骨肉瘤是临床上常见的多发的恶性肿瘤，容易发生在青少年的长骨干骺端，恶性程度极高，复发率和转移率均较高。目前临床对骨肉瘤的治疗一般采用手术切除和新辅助化疗方式,患者的5年生存率已达到60%。近年来虽然在骨肉瘤治疗方面取得了显著的疗效，但是因肿瘤多药耐药的存在，治疗效果仍需提高和完善。骨肉瘤多药耐药机制的研究已经成为了目前肿瘤分子生物学领域的热点和难点，解决肿瘤多药耐药难题有望成功。肿瘤多药耐药主要的耐药机制是由P-gp糖蛋白介导的。P-gp是一种由MDR1基因编码的、相对分子质量为170KD的跨膜蛋白，由1280个氨基酸组成。其在许多正常组织，如肠粘膜上皮细胞、肝胆管细胞、肾上腺皮质、肾小管细胞以及血脑屏障均有较高表达，在耐药肿瘤细胞中有更高表达。多种抗肿瘤药物通过扩散进入细胞内后，被p-gp识别结合。P-gp发生构像改变，通过消耗ATP获得能量，将药物泵出到细胞外，形成多药耐药。有学者研究发现，BCRP蛋白在乳腺癌细胞中由PI3K/AKT信号通路调节；另有报道，对于有雌激素受体表达的乳腺癌细胞，雌激素能激活PI3K/AKT信号通路调节最终导致P-gp,BCRP蛋白表达的改变；本团队成员以前研究发现，雌激素等刺激因子可以激活PI3K/AKT/SSH1L信号通路。Kazuhiro Katayama等证实阻断MAPK信号通路能下调p-gp蛋白的表达。LIMK1是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，一种相对分子质量为70KD的蛋白。它主要存在于细胞质中，能在胞质和胞核之间自由地穿梭。其主要生理功能是通过使Cofilin失活，从而参与细胞骨架蛋白重组，是联系细胞外刺激和细胞内骨架蛋白稳定性的重要枢纽。近年来LIMK1在肿瘤发生中的意义引起广泛关注。有研究发现LIMK1和高浓度磷酸化的Cofilin在前列腺癌细胞中过度表达，抑制LIMK1后能使细胞静止在G/M期从而改变细胞增殖的状态。另有报道，LIMK1在乳腺癌生长、血管生成和侵袭中起重要作用。我们最新研究表明，通过RNA沉默技术抑制LIMK1后，骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力均有所下降。本研究以LIMK1为靶点，进一步探讨LIMK1在骨肉瘤细胞增殖、迁移和肿瘤耐药方面的作用，为新的研究理论提供理论基础和实验依据。我们在以前的研究中成功地建立了人骨肉瘤多药耐药细胞系，并研究了耐药细胞的生物学活性变化。本研究选取体外培养的人成骨肉瘤细胞MG63及MG63/VCR(MG63耐长春新碱细胞)为主要研究对象，应用平板克隆形成实验和细胞划痕实验检测LIMK1在MG63及耐药细胞的增殖、迁移中的作用。平板克隆形成实验显示耐药细胞增殖较亲本细胞在相同时间内数量更多，而将LIMK1沉默后，耐药细胞的增殖效果则弱于亲本细胞。细胞划痕实验显示LIMK1能明显促进耐药细胞迁移。我们应用多种实验技术检测亲本细胞和耐药细胞中MDR1和LIMK1基因及蛋白的表达情况。实验发现耐药细胞中基因及蛋白表达量均高于亲本细胞。运用基因沉默技术将LIMK1沉默后，耐药细胞IC50和P-gp蛋白量表达均明显降低。通过加入不同浓度的VCR刺激MG63/VCR细胞采用Western-blot技术检测AKT活性改变情况及可能与LIMK1的关系，结果说明VCR可刺激耐药细胞使磷酸化的AKT表达下降，可能与抑制细胞增殖、促进细胞凋亡有关。