第一部分：循环miR-221/222在胶质瘤诊断与预后中的价值胶质细胞瘤是目前神经系统肿瘤诊治中最具有挑战性的一类,其标准人口调整后发病率(根据每个调查所涉及的区域人口进行标化)约为4.67-5.73/10万,占所有确诊的恶性中枢系统原发性肿瘤的45.6。其中恶性程度最高,中位生存时间最短,预后最差的胶质母细胞瘤(GBM, WHO IV级)的标准人口调整后发病率为0.59-3.69/10万人。对于GBM,即使采用目前最强有力的综合治疗措施,其5年生存率仍然仅为0.1%-8.9%。由于胶质瘤生长部位特殊,造成的疾病负担较全身其他肿瘤也更重。因此,寻找早期诊断胶质瘤快速有效的方式,无疑是改善胶质瘤预后的一项重要途径。时至今日,胶质瘤的诊断依赖于CT、MRI等影像学及活体组织病理学检查等手段。但较高的检查费用和活检的高风险(立体定向活检并不比肿瘤全切、肿瘤全切更安全)限制了其在早期诊断特别是在人群中的普查的应用。肿瘤蛋白p53 (TP53)、第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)等分子生物标志物,是目前学术界越来越重视的一类可能实现胶质瘤早期诊断特别是实现人群中普遍筛查的新方法。但其在血液与组织中的稳定性限制了其作为普查手段的进一步推广。小分子核糖核酸(microRNA),是一类在90年代后期进入人们视野的单链非编码RNA,其长度多在22-25个核苷酸左右。MicroRNA在真核生物中的主要生理作用目前认为是与mRNA结合,在转录后水平对数个到数十个基因的表达进行调控,而其在肿瘤细胞中则同时起着肿瘤抑制与促肿瘤的“双极效应”。MicroRNA在肿瘤细胞的发生、增殖、侵袭、迁移以及上皮间充质转化等各个关键环节都起着重要作用,影响着肿瘤细胞的生物学形状。因而,我们有理由认为,microRNA的失调极有可能与肿瘤特别是实体肿瘤的始动和进展有着密切的关联。值得一提的是,microRNA检测所需的样本来源广泛,其存在于至少12种以上的生物体液,如脑脊液、血液、尿液、唾液、气管灌洗液甚至初乳当中,并且对核糖核酸酶(Rnase)存在着耐受性,而且与其他分子生物标志物相比,microRNA结构复杂度明显较低,其序列在不同的物种中具有高度的保守性,便于研究及检测,因而有极大的作为肿瘤筛查手段的潜力。miR-221与miR-222,是由位于X染色体间隔区距离为727bp的串联基因簇编码而成的。其二者在核苷酸序列上极为接近,具有相同的“种子序列”(seed sequences).因而在调控过程中常表现为同步变化的趋势,在病理生理效应表现为协同作用。目前研究已经证实,miR-221/222对于甲状腺癌、乳腺癌、口癌等多种癌症的早期诊断具有相当大的预测价值。而且,已经有些试验结果证实,miR-221/222还与肿瘤的预后有密切关系。因而我们推测循环miR-221/222在胶质瘤中,可能也有同样的早期诊断与预后的应用价值。目的：探讨循环miR-221/222在胶质瘤诊断与预后中的应用价值。材料与方法：1.材料：收集健康人和经病理诊断确诊的胶质瘤病人的静脉血标本各51例与50例。收集对照组与实验组的临床资料如年龄、性别、吸烟史、饮酒史、家族肿瘤史与电离射线暴露史,并持续追踪病人生存情况至实验结束。2. qRT-PCR测定循环miR-221/222在对照组与实验组的相对表达水平。3.统计学分析：采用SPSS 19.0软件,采用χ2检验确定实验组与对照组在miR-221/222表达上的差异。并绘制受试者工作曲线(ROC),确定miR-221/222对胶质瘤诊断的敏感性与特异性。Kaplan-Meier法绘制生存曲线,并用log-rank检验进行分析。4. meta分析：通过纳入在PubMed, Embase和Cochrane Library数据库中从2010到2014年间,关于miR-221/222与肿瘤关系的17篇文章中的23个试验,采用STATA12.0与SPSS19.0软件分析循环miR-221/222对肿瘤诊断的价值。结果：1. qRT-PCR显示,胶质瘤病人中循环miR-221/222高表达,与对照组差异有统计学意义(p=0.001)。胶质瘤组病人循环miR-221/222表达高于无瘤健康对照。2.由受试者工作曲线(ROC)计算得出miR-221曲线下面积AUC为0.83(95%CI 0.74-0.93), miR-222曲线下面积为0.88(95% CI0.79～0.98)。miR-221的cut-off值为1.49,敏感度和特异度为73.5%与80%,miR-222的cut-off值为2.67,敏感度与特异度分别为85.7%与87.5%。3.根据循环miR-221与miR-222相对表达情况分为高表达组与低表达组,Kaplan-Meier生存曲线log-rank法检验表示血浆中miR-221与miR-222高表达与较差的预后之间存在着明显的关系(miR-221:HR= 2.40; 95% CI,1.42～4.05; miR-222:HR= 2.81; 95% CI,1.70～4.65)。4. Deek漏斗图(图1-5),p=0.12>0.05,漏斗图回归直线两侧对称,因此在统计学上可以判定所纳入文献不存在发表偏倚。由于该组分析数据I2>50%, P<0.1 (I2 sensitivity=73.34%,95%CI:62.36-84.32%, P<0.01; I2 specialtivity=69.16%, 95% CI:55.96～82.36, P<0.01),可以认为所纳入的研究有中度以上的异质性,采用随机效应模型(random effects model)对本组数据进行分析。计算得合并敏感度(pooled sensitivity)为0.76(95% CI：0.70～0.80),合并特异度(pooled specificity)为0.75(95% CI：0.69～0.80),阳性似然比(positive like ratio)为3.00(95%CI:2.30～3.90),阴性似然比(negative like ratio)为0.33(95% CI：0.26～0.42),诊断优势比(diagnostic odds ratio)为9.0(95% CI：6.0-15.0)。因此可认为,miR-221/222对肿瘤的诊断有重要提示价值。针对miR-221,绘制汇总受试者工作曲线(sROC),计算得合并敏感度为0.76(95% CI：0.66～0.83),合并特异度为0.74(95% CI：0.66-0.81),AUC为0.82。对于miR-222,由sROC得合并敏感度为0.76(95% CI：0.66～0.83),合并特异度为0.76 (95% CI:0.66～0.83), AUC为0.82。结论：1.本部分实验成功的检测了胶质瘤患者与健康无瘤对照的循环miR-221/222相对表达水平。2.循环miR-221/222表达水平可以用于区分胶质瘤与正常无瘤对照,胶质瘤病人的循环miR-221/222表达水平明显高于健康人。3.循环miR-221/222表达水平可以用来预测胶质瘤患者的预后,高表达者预后较差。3.循环miR-221/222表达水平可以用来预测胶质瘤患者的预后,高表达者预后较差。第二部分：基于CED的中枢神经系统局部给药新技术的研究由于血脑屏障与血肿瘤屏障的存在,98%的小分子药物和所有的大分子药物都不能进入脑内形成治疗所需的血药浓度。局部给药技术(local drug delivery)可以避开血脑屏障直接在给定的部位进行给药。但基于简单扩散的局部给药技术,如Carmustine晶片(Gliadel(?))等,不仅给药效率较低,药物扩布范围仅为给药部位周围1-2mm内,分布也呈现明显的不均一特质,且其药物释放模式及释放量无法精确调制(虽然Gliadel(?)是可控型化疗晶片,但其所含大部分药物均在2周内释放完成,且一旦置入,无法调整)。增强对流给药技术(CED)是近些年发展起来的一种脑内局部给药新技术。相比传统局部给药技术,其优点在于：(1)利用微正压介导的层流效应进行药物扩布,药物扩布的效率可大大提高；(2)药物无论分子量大小,利用该技术都能将透过血脑屏障送至靶部位；(3)利用iPlan Flow (BrainLab,德国)等软件不仅能事先预测药物扩布模型,而且能够实现药物扩布实时监控,给药模式与剂量可以非常方便的以无线传输的形式实现精确控制；(4)CED局部给药技术呈现的是一种局部高血药浓度、全身极低血药浓度的理想状态,可以有效的避免高毒性药物化疗带来的不良反应；(5)由于不需要类似Gliadel(?)作用时的首剂饱和量,CED造成局部神经功能缺损的可能性大大降低。目前所报道的由于CED所造成的神经功能缺损都是可逆的,随着给药速度的调整都完全恢复。CED的巨大优势使得学者们纷纷将其引入临床前与临床研究,CED首先在神经肿瘤中被报道研究,随后在帕金森氏病、亨廷顿氏病等各个领域均有大量CED研究的报道。但十数年过去了,在理论与动物试验中均取得了非常瞩目结果的CED技术,目前仅有一项Ⅲ期临床试验(PRECISE试验)完成。虽然PRECISE试验取得了不错的结果,复发胶质母细胞瘤患者的平均无进展生存期延长了6个月(17.7 vs 11.4,p=0.0008),但仍因中位生存时间获益未超过50%(相比阳性对照组)的预设目标而宣告失败。分析CED技术由临床前研究向临床研究转化失败的原因,有学者提出是由于脑组织阻塞了给药通道造成给药失败。我们在最近的一项向恒河猴亨廷顿模型壳核定向CED注射siRNA的研究中发现在所有的59个颅内留置给药管中,11个被吸入的脑组织堵塞无法进行正常的CED局部给药。分析原因,可能是在颅内置管过程中,部分脑组织被拔出导丝时产生的负压由针孔吸入留置管内,并在随后7天的低流量灌注期(6μl/day),脑组织在管内持续生长进而导致留置给药管阻塞(低流量灌注期可以使脑组织有充分的弹性回缩时间,与颅内留置管更好的贴合减少返流,有利于增加药物扩布范围)。为了实现CED所需要的颅内留置管针尖微正压,必须比采用27GA更细的针头这种针头的药物流出孔直径小于0.2 mm,非常容易堵塞(目前的主流是采用33GA的针头,给药效率更高且损伤更小,其流出孔直径为0.1mm,但更容易阻塞)。其次,目前的临床前研究,多数利用的是啮齿类动物模型的短时程CED给药方案。由于啮齿类动物脑容积与复杂程度与人体的巨大差异,从啮齿类动物模型获得的研究结论很可能并不适用于人体。因此,我们也迫切需要在非人类灵长类动物模型等大型动物体内进行CED技术的研究,评价长期CED局部给药的安全性。由此可见,开发新的CED技术,在不同的给药模式、颅内不同的部位,实现精确的将留置管放到给定部位,并长期通畅的工作,已经成为将CED技术由实验室向临床转化的关键。因此,我们设计了体外实验用以证实颅内留置管阻塞的原因,并利用体外实验结果改进了CED置管的手术体系,经107只恒河猴111例CED置管验证,我们安全的将分子量不同的药物,以不同的给药模式、给药剂量、给药速度精确的送到了预设靶位置。所有颅内留置管在工作时长(21-90天)内无任何堵塞现象发生。目的：(1)探讨造成CED颅内留置管阻塞的原因,(2)建立新的CED手术体系,实现在脑不同部位的精确置管并安全长期给药。(3)建立新的CED手术体系,保持留置管长期畅通。方法：(1)体外试验：导管阻塞验证实验验证在CED颅内留置管置入过程中,脑组织可被吸入造成留置管阻塞。影响因素验证试验采用与试验中相同的手术步骤,分别采用干燥实芯(空芯)导丝与无菌PBS浸润过的实芯(空芯)导丝,采用正常与慢速两种导丝推出速度,记录留置管内的负压的变化,寻找影响留置管内负压变化的因素。体内试验：1.根据术前磁共振,确定置管位置。2.改进CED置管手术步骤,在壳核、黑质等部位置管。3.手术后立即进行磁共振检查,确认置管位置,计算置管精确度、检查留置管腔是否通畅。4.给予不同的药物、采用不同的给药模式和给药速度进行CED颅内给药。5.21天-90天后,行颅脑磁共振,评估药物扩布情况并计算留置管便宜角度安乐死动物,检查留置管是否畅通。6.免疫组织化学检测置管对脑组织造成的损伤情况。结果：1.导管阻塞验证实验证实：采用实芯导丝介导颅内留置管置入,脑组织的确可以被吸入留置管针孔内造成药物流出道阻塞,但是除非是采用极速退出实芯导丝(43.2 mm/min),被吸入的脑组织量并不足以完全堵塞导管流出道。因此,我们的前期猜测即吸入导管针孔药物流出道的脑组织可能继续生长直至导管完全阻塞是完全有可能的。导管阻塞影响因素验证实验证实：(1)单独使用空芯导丝介导颅内留置管置入并不能消除移除导丝时产生的负压：(2)当导丝与颅内留置管被润湿后,负压值可能增大,甚至达到以前的两倍;(3)减慢导丝撤出的速度,是降低管内负压的有效方法。2.所有动物对置管过程以及长期带管生存耐受良好。所有动物无任何感染及异常表现,无神经功能缺损表现。所有动物进食进水如常。所有动物体重变化均保持在3.4%以内。3.111个颅内留置管平均置管误差为0.86±0.61mm。置管漂移角度：矢状位平均漂移为3.0+2.61°,冠状位平均漂移为2.6±2.41°。所有CED颅内留置管,都精确的置入指定位置,经过长时程CED局部给药后,位置未发生明显变化4.111个颅内留置管,经过不同时长(21-90天)的不同给药时长,采用不同的给药模式与给药速度,成功的将药物送到了指定靶点,所有留置管保持通畅,管腔通畅率达到了100%。5.免疫组化显示(1)所有组织学切片中可见1mm左右的针道,针尖部位均位于解剖学指定部位；(2)沿针道及针尖周围可见部分单核细胞浸润；(3)针尖部周围见大量细胞外液浸润现象,在局部药物扩布区可见少量血管周炎性细胞浸润；(4) Nissl染色示沿针道及针尖周围微量神经细胞缺失现象,未见明显的成簇的细胞群缺失。结论：1.本实验成功的鉴定了CED局部给药的过程中,颅内留置管阻塞的原因。2.本实验证明了采用新的CED手术体系,可以实现安全长期精确的CED局部给药。3.本实验证明了新的CED手术体系,可以长期保持颅内留置管通畅。