鸭瘟(duck plague)又称鸭病毒性肠炎(duck virus enteritis),是鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病。本病发病快、死亡率高,是目前世界各国水禽业危害最严重的传染病之一。该病的病原鸭瘟病毒(Duck Plague virus, DPV)是疱疹病毒科(Herpesvirales)、α疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)、马立克氏病毒属(Mardivirus)的成员之一。但由于DPV的研究起步晚,其分子生物学研究远远落后于其它疱疹病毒。一段时间以来对于DPV的研究多集中于流行病学、诊断和防治等方面；与其分子生物学特性相关的基础研究,如病毒的基因组结构、物理图谱、病毒基因功能以及病毒在机体细胞和组织中的复制及致病机理、病毒感染过程以及机体抗病毒感染机制等多方面研究均有许多不明之处。因此本论文的主要目的就是希望对本实验室测序获得的鸭瘟病毒基因组序列进行解析；并通过构建一个可以对DPV进行细菌遗传学操作的平台,为DPV的基因功能研究提供技术手段的支持,此外利用该平台用两步RED重组敲除UL55基因,验证此平台的可行性并初步阐释UL55功能。主要研究内容如下：1鸭瘟病毒中国强毒株基因组信息解析对本实验室测序获得的鸭瘟中国强毒株的基因组序列进行生物信息学分析。鸭瘟病毒中国强毒株基因组组成为双股线状双链DNA:UL-IRS-US-TRS,是典型的D型疱疹病毒基因组结构。DPV CHv基因组全长162,175 bp,GC含量为44.89%,包括潜在的76个能编码功能蛋白的ORF。BLAST搜寻相似性序列发现五条与DPV CHv同期或之后提交的其他鸭瘟病毒毒株全基因组序列,他们间具有高度同源性,进化树分析显示六株DPV病毒按地域和毒力差异进行分类,DPV CHv处于进化树的中间位置。对基因组编码区的ORF进行扫描分析发现,六株DPV在UL、US区域分别有23、5个ORF在核苷酸水平上存在整个ORF的缺失、部分序列插入、缺失等情况出现,这些突变的产生可能是造成六株不同来源毒株毒力和地理差异的主要原因。而DPV基因组中不存在核苷酸序列插入或缺失的53个ORF在氨基酸水平上高度同源,多为DPV基因组的保守性基因,不受病毒传代致弱及地域差异的影响,编码蛋白大多为与病毒DNA代谢相关的结构蛋白。密码子使用模式分析结果显示其在基因组密码子的使用上偏向A/T结尾的密码子,其密码子使用模式主要受突变压力的影响。将其与人类、大肠杆菌、酵母的密码子使用模式进行比较,结果表明鸭瘟病毒的密码子使用模式与酵母系统更为接近。2鸭瘟病毒UL55基因生物信息学分析DPV UL55基因由561bp核苷酸组成,包括一个完整的开放性阅读框,编码一个由186个氨基酸组成的20.7981kDa蛋白质。UL55蛋白没有信号肽及跨膜区。密码子分析显示UL55基因偏向A/T结尾的密码子,密码子使用模式与人类最接近。UL55蛋白整体表现出亲水性,抗原表位主要集中在相应亲水区域的无规则卷曲,其功能与病毒的装配、出芽、成熟和释放相关。基于核苷酸序列的进化树分析显示DPV属于马立克氏病毒基因属的一员。3鸭瘟病毒UL55基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备通过将UL55基因通过克隆到表达载体pET32a(+)上实现对UL55蛋白的原核表达,试验表明重组UL55基因能在大肠杆菌BL21(DE)中进行融合表达。通过优化诱导表达条件,UL55重组蛋白能在37℃条件下,通过0.8mmM的IPTG诱导表达4h产生大量非可溶形式的包涵体蛋白。将包涵体蛋白通过裂解后进行纯化及复性处理再与兔抗DPV CHv多克隆抗体进行免疫印迹反应,结果表明纯化复性后的UL55蛋白具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。复性后的UL55蛋白免疫兔子制备的高免血清能够与UL55重组蛋白发生良好的免疫反应。4原核表达UL55蛋白作为抗原检测DPV血清的间接ELISA方法的建立本方法是基于纯化的重组UL55原核表达蛋白建立的可以检测DP血清的间接ELISA法,该方法特异性强,对抗鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、鸭疫里默氏菌(RA)、鸭大肠杆菌(E.coli)、鸭源沙门氏菌(Salmonella)、肿头性出血症病毒和鸭源流感病毒的阳性血清进行检测,结果均为阴性；该方法的对酶标板内或板间重复试验显示变异系数均小于10%,能检出经1：6400倍稀释的DPV弱毒疫苗免疫鸭的阳性血清。将其与经典的中和试验及DPV全病毒包被的ELISA同时检测50份感染了DPV的临床鸭血清样本,发现其对DPV IgG的检出率介于中和试验和DPV-ELISA之间。由于其制备方法简便、操作简单,特异性、灵敏性较高。且不存在散毒的风险,具有良好的应用前景,为进一步组装成试剂盒奠定了基础。5鸭瘟病毒UL55基因转录、表达时相分析以β-actin基因作为内参基因,用相对荧光定量方法对UL55基因在体外感染宿主细胞中的转录情况进行了分析。转录时相分析结果表明UL55基因在转录后的0-8h内处于一个较低的水平；12h后开始迅速增加直至在感染后36h达到转录峰值,之后开始逐步下降,直到感染后的60h仍然可以检测到大量转录的UL55基因,UL55基因的转录过程可以被核酸抑制剂更昔洛韦抑制,说明UL55基因是严格依赖于DNA合成的γ2基因。Western-blot分析体外感染宿主细胞中UL55基因的表达时相表明UL55蛋白的表达水平也表现出相似的规律,进一步佐证了UL55基因为γ2基因的结论。6细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台构建通过多步克隆构建了含TK基因同源臂、报告基因EGFP和细菌人工染色体核心功能元件的重组鸭瘟病毒转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11,将其与DPV CHv病毒核酸共转染获得了重组病毒DPV CHv-BAC-G。利用EGFP报告基因的指示作用,通过8轮噬斑纯化获得了纯化的重组病毒。提取环化时期的重组病毒DPV CHv-BAC-G,电击转化至DH10B细胞中,获得了能够在细菌中复制的重组病毒转化子。将克隆化的病毒质粒pBAC-DPV转染至宿主细胞DEF,成功拯救出重组病毒DPV CHv-BAC-G。拯救出的重组病毒可以以细菌和病毒两种形式存在,能够实现在细菌和宿主细胞内的同时复制,有利于利用原核系统成熟的基因操作手段研究原本仅能在细胞水平研究的鸭瘟病毒,成功建立细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台。7重组鸭瘟病毒UL55基因缺失株的构建及其体外生物学特性研究在构建的细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台基础上,利用大肠杆菌细胞内的两步RED重组技术构建UL55基因缺失株及其回复突变株。构建的回复突变株克隆能够通过转染DEF细胞获得拯救产生与亲本相同的致细胞病变,酶切图谱与亲本株DPV CHv-BAC-G无差异,是为真正的回复突变株。空斑试验、一步生长曲线和致病性比较结果表明,构建的UL55缺失株和回复突变株与预期结果一致,能产生与亲本株DPV CHv-BAC-G相似细胞病变效应、形成形态及大小相似的空斑、在感染细胞中展现出相同的增殖周期。8 DPV UL55基因在感染宿主细胞体内的定位分析以制备的兔抗UL55多克隆抗体作为一抗,用间接免疫荧光的方法检测UL55基因编码蛋白在感染细胞内的动态分布。结果显示,UL55蛋白最早在感染后的5.5h内开始在细胞质大量表达,并随着时间的推移表达量逐渐增多,其表达量在感染后的22.5h达到峰值。之后UL55蛋白的表达量逐步下降,并从细胞质内的散在分布颗粒逐渐形成荧光斑向核膜周边转移,大量存在于核膜两极。之后随着时间的推移,UL55蛋白的荧光逐渐消失,推测其随着病毒复制周期的结束和细胞的崩解而消失。9 DPV UL55与UL26.5基因在感染宿主细胞体内的定位分析UL55蛋白和UL26.5蛋白在细胞内的共定位结果显示,UL26.5和UL55蛋白在感染细胞内邻接并部分重叠,但当DPV不表达UL55蛋白时,UL26.5蛋白的定位没有变化,表明UL55基因的缺失并不影响UL26.5在核内的定位和其功能的发挥,预示着UL26.5蛋白形成的核衣壳的装配由包括UL55在内的多个蛋白完成,UL55蛋白参与病毒的装配,但并不是必需。