论文部分内容阅读
猪伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病毒（PRV）引起的一种传染病,对世界养猪业造成严重危害。PRV属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科,该病毒可感染许多种类的哺乳动物,但猪是PRV的自然宿主和唯一潜在的携带者。流行性乙型脑炎（JE）是由流行性乙型脑炎病毒（JEV）引起的一种蚊媒性人畜共患传染病。感染JEV可引起怀孕母猪流产、产死胎或木乃伊胎,也可引起公猪的睾丸急性炎症反应或不育,严重影响养猪业的持续发展。本研究采用PCR方法扩增PRV gE基因的主要抗原表位区,构建原核表达质粒pET-gE,及利用本实验室保存的原核表达质粒pET-EIII,使两种重组质粒在大肠杆菌中进行高效表达。在SDS-PAGE分析基础上,结合ImageJ和Graphpad prism 5.0软件的分析,对影响重组gE蛋白和重组EIII蛋白表达的诱导温度,诱导起始OD600,及IPTG浓度等因素进行了优化。确定重组gE蛋白最佳表达条件为:当菌体浓度达到1.2左右时,加入终浓度为1.5 mM的IPTG,16℃恒温摇床175 rpm过夜振荡培养。重组EIII蛋白最佳表达条件为:当菌体浓度达到1.6左右时,加入终浓度为1mM的IPTG,16℃恒温摇床175 rpm过夜振荡培养。为得到高纯度的重组gE蛋白和重组EIII蛋白,对纯化条件进行了探索,确定重组gE蛋白结合液中咪唑浓度为100 mM,蛋白洗脱液中咪唑浓度为500 mM。确定重组EIII蛋白结合液中咪唑浓度为100 mM,蛋白洗脱液中咪唑浓度为300 mM。纯化后的蛋白分别进行Western blot鉴定,重组gE蛋白只与PRV标准阳性血清反应,重组EIII蛋白只与JEV标准阳性血清反应,与阴性血清均不发生反应。表明纯化的重组gE蛋白和重组EIII蛋白具有良好的特异性和反应原性。利用原核重组表达的gE蛋白作为包被抗原,并对各反应条件进行优化,建立了检测PRV血清抗体的间接ELISA方法。ELISA反应程序为:包被抗原以浓度0.5μg/mL 37℃包被2 h;封闭液为1%明胶+2.5%BD脱脂乳,37℃封闭2.5 h;血清稀释10×,37℃孵育45 min;酶标二抗的最佳稀释度为3μg/m L,37℃孵育60 min;显色条件为37℃孵育15 min;利用TG-ROC方法确定临界值为0.721,即当S/P≥0.721时,结果判定为阳性;S/P<0.721时,结果判定为阴性。以该方法检测PRV阳性血清和其他猪病病原阳性血清,除了PRV阳性血清呈阳性外,其他猪病病原阳性血清的检测结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。批内重复和批间重复的最大变异系数分别是5.95%和9.62%,表明该方法重复性良好。此外,使用该方法对250份临床血清进行检测,与国内外4种商品化试剂盒比较符合率最高为83.6%。该方法可以用于PRV的临床检测,为PRV流行病学调查和防控提供了一种快速有效的检测方法。