由病原微生物感染引发的细菌性腹泻,是许多发展中国家常见的健康问题。特别是年龄在5岁以下的婴幼儿腹泻以及旅行者腹泻,目前并没有可用疫苗。临床研究数据显示单一致病菌疫苗,无法应对病原菌的多样性和多态性,导致无法引起对于细菌性腹泻的整体保护。因此我们的主要研究内容是开发新型安全,有效的联合腹泻疫苗制剂。核酸疫苗作为联合疫苗载体具有便于实现多抗原联合免疫、制备过程简便快速,可同时诱发体液免疫和细胞免疫等优势,但存在在大型动物以及人类中的免疫应答水平较低等缺点。因此本研究的目的为研发一种同时针对ETEC和Shigella两种病原菌的多价DNA疫苗,研究内容主要涉及多价DNA疫苗的设计和高效表达载体的选择,因此,本研究开展了如下的工作,并取得相应成效:首先,针对ETEC致病菌的主要致病因子LTB、CfaE、CssA,S.Sonnei致病菌的主要致病因子IPaB,应用生物信息学软件对其进行B和T细胞表位的筛选,选择16个优势表位包括线性B细胞表位(4个)、非线性B细胞表位(4个)、HTL表位(4个)以及CTL表位(4个),理性设计MEG和MB多表位序列,通过3D结构模拟及抗原性预测,最终获得抗原指数高达0.94的多表位序列。其次,选择可高效表达外源蛋白的复制子载体pSFV,构建重组质粒pSFV-MEG和pSFV-MB作为DNA候选疫苗。在体外细胞中,对其进行免疫荧光和细胞凋亡能力的初步检测。结果表明,MEG和MB抗原蛋白可在真核细胞中正常表达。最后,利用脂质体-聚合物杂化纳米颗粒递送系统(PLNPs),制备DNA疫苗制剂,并在BALB/C小鼠中进行免疫效果评价。实验结果显示,候选疫苗pSFV-MEG/PLNPs,以100μg/次的剂量,经三次免疫小鼠后,与PBS和空白PLNPs阴性对照组相比,可诱发小鼠血清中显著的IgG抗体水平(P<0.01),且相较于普通疫苗载体,pSFV疫苗载体在血清中诱导产生更高的抗体水平,具有显著性差异(P<0.05);小鼠脾脏T淋巴细胞中,CD4+T细胞比例增加,CD8+T细胞比例下降,CD4+T/CD8+T 比值增加,表明候选疫苗pSFV-MEG/PLNPs可激活机体的细胞免疫系统。因此证明pSFV-MEG/PLNPs可作为抗流行性腹泻的候选疫苗。综上,本研究利用生物信息学工具对流行性腹泻主要致病菌进行B细胞和T细胞抗原表位筛选,经过理性设计,构建复制子DNA疫苗表达载体(pSFV-MEG),应用脂质体-聚合物杂化纳米颗粒递送系统,制备相应的DNA疫苗制剂,经过抗体水平及细胞免疫水平检测,实验结果表明pSFV-MEG/PLNPs疫苗可以诱发较强的体液免疫和细胞免疫,因此可作为有潜力的候选疫苗,为解决细菌性腹泻提供新的设计思路和研究基础。