胸腺上皮性肿瘤(Thymic Epithelial Tumors，TETs，后简称胸腺瘤)的病理诊断和分类长期以来是肿瘤病理中最有争议的领域之一，也曾一度将胸腺瘤与淋巴瘤混在一起分类，表明多年来人们对胸腺瘤的认识并不清楚。曾有过多种胸腺瘤分类方案，各自代表不同的学术观点，形成了长期的争议。1999年底，WHO肿瘤分类委员会提出了“既保留各家意见、又相对客观、保持‘中立’的态度”的折中方案，在世界各国胸腺瘤研究之间达成了一个初步的共识。新WHO分类的主要证据来自形态学，而反映各亚型组织源性关系的免疫表型、遗传学以及胚胎发生方面的证据尚不足，争议仍存。争议的焦点归结在，胸腺上皮在经历肿瘤转化时的生物学特性是否被其前体细胞发育定向所严格限制，从而在临床上表现出“皮质”、“髓质”的不同行为。这给人们留下了很大的研究空间。 胸腺瘤发病机理及其组织源性关系的研究长期以来受多种因素的影响，进展缓慢。首先，胸腺瘤细胞的形态复杂，在一个相当的时间内困扰了病理学家，影响了胸腺瘤的深入研究。其次，胸腺瘤发病率较低，胸腺癌的发病率更低，较大浙江大学博士学位论文周韧样本的收集较为困难。再者，胸腺在淋巴造血以及免疫系统形成中具有重要地位，脚腺的组织发生、生理功能以及在免疫网络中的作用更为复杂。同时，胸腺瘤在临床上还伴有高发的自身免疫性疾病，这些特点都给胸腺瘤研究增添了复杂性。 早期的胸腺瘤遗传学研究局限于胸腺瘤的核型分析，以个例报道为主，重复性较差。近年来有一些零散的研究逐渐涉及一些肿瘤相关基因对胸腺瘤和胸腺癌发病的可能作用。近年最引人注目的进展是有关高亲和性和低亲和性神经生长因子(TrkAI和p75NGFR)与胸腺瘤发病的相关性。最近通过比较基因组杂交(CGH)技术较系统的研究了胸腺瘤的遗传变异，显示出胸腺瘤中存在非随机的染色体异常。该研究框架性的提示了与胸腺瘤发病相关的染色体区段，同时也显示不同胸腺瘤类型遗传变异之间的相关性。近年的研究也涉及到胸腺瘤发病机理中某些单个(或几个)基因的作用，如p16(CDKNZA)、RBZ，BCL一2和H一RAS等，但无人报道遗传变异之间的关系和遗传变异事件顺序，以及它们与胸腺瘤病理类型之间的相关性。 出于上述考虑，本研究拟采用CGH和微卫星DNA分析两种不同“精度”的检测方法对淋巴细胞相对较少、病理学上具有代表性的洲0一A型，WHO一B3型和WHO一C型在内的胸腺瘤病理类型的遗传背景首先进行染色体不平衡和等位基因不平衡分析，后者能反映数十个碱基范围内的遗传物质丢失和扩增，这同时也有利于检测因DNA误配修复基因功能失常而引起的DNA微卫星不稳定性，试图确定涉及胸腺瘤发病的肿瘤相关基因和位点以及它们之间可能存在的关系，从而深入研究胸腺瘤遗传学发病机理。本研究的意义在于探讨胸腺上皮在经历肿瘤转化时的遗传变异特性以及与其前体细胞发育定向限制之间的可能关系，同时也探讨胸腺瘤遗传变异特性与临床上表现的生物学行为之间可能的关系，以期揭示胸腺瘤的遗传发病机制中某些鲜为人知的事实，并为胸腺瘤病理学分类和诊断提供进一步的遗传学证据。浙江大学博士学位论文周韧 第一部分WHO一型、B3型及C型脚腺上皮性肿瘤染色体不平衡分析 采用比较基因组杂交技术(eomparative Genomi。Hybridization，eeH)技术对肿瘤进行染色体不平衡分析，来搜索和筛选肿瘤相关基因位点，是癌症研究中很有用的分子细胞遗传学策略之一。CGH能够提供肿瘤样本中DNA序列拷贝量改变，包括扩增(amplifiCations)，也称放大或获得(gains);和缺失(deletions)，也称丢失(Los ses)，并且把这些改变定位在正常染色体上。在本研究中我们期待对选定的胸腺瘤病例采用CGH进行染色体不平衡分析，目的在于初步筛选与胸腺瘤发病可能相关的染色体区段，为下一步采用更精确的PCR为基础等位基因不平衡分析寻找到研究目标，同时也有利于这双重方法来验证我们的研究结果。一材料和方法:1.病例收集:按病理流水号收集德国维尔茨堡大学病理研究所1985年至1999年间的胸腺瘤病例，选择淋巴细胞含量较低的21例，其中翻0一A型7例，洲O一B3型10例和WHO{型4例进行遗传学研究。所有的病例由两位胸腺瘤专家根据WHO新分类标准来进行病理诊断。免疫学分型采用文献报道的常规方法进行。按Masaoka和Mukai的标准进行临床分期。2.徽切创和DNA抽提每个病例DNA抽提前先进行H.E.切片观察，以决定是否全部组织有足够的上皮性肿瘤细胞。观察到含有灶状淋巴细胞区的病例，则根据文献进行微切割操作。根据常规酚一氯仿抽提法抽提 DNA。3.肿瘤DNA和正常对照DNA的标记采用DNA缺口翻译法分别用生物素一16一dUTP和地高辛一11一dUTP标记肿瘤DNA和正常对照DNA。正常对照DNA来自正常人的淋巴细胞。DNA缺口翻译法参考文献稍经改良后进行。1%琼脂糖凝胶中电泳，检查探针片断的分布。片断应当是500~2000bp。4.比较基因组杂交(Co.paratlve Genomrc Hybr一d一zation，CGH)?