地方性氟中毒是一种严重危害人体健康的全身性疾病。流行病学调查证实,氟可影响儿童智力发育,损害学习记忆能力。动物实验研究也发现,海马是氟神经毒作用的靶部位。近年来细胞凋亡在氟毒性机制中的作用已引起关注,人们已从多方面探讨了氟诱导凋亡机制,自由基损伤是其中之一,但氟对神经系统氧化应激和凋亡的影响报道较少。突触可塑性是学习记忆获得、巩固和保持的基础。而在突触形成及其可塑性的调节中,神经细胞粘附分子(neural cell adhesion molecules,NCAM)起着极为关键的作用。在神经系统中存在三种主要的受发育调控的NCAM亚型:NCAM-180、NCAM-140和NCAM-120,是同一基因随机剪切的结果。NCAM主要通过同源性和异源性作用介导细胞的黏附,激活跨膜信息传导,影响细胞迁移、树突延伸及突触的形成,在神经发育及学习记忆形成、巩固和再生等重大脑功能中起着重要的作用。因此,我们设想氟可能通过影响海马组织NCAM的表达而产生以学习记忆损害为主的神经毒作用。本次研究以大鼠海马细胞为研究对象,用低剂量氟24 h染毒后,观察氟对海马细胞氧化应激、DNA损伤和凋亡以及NCAM mRNA和蛋白表达水平的影响,初步揭示细胞调亡和NCAM在氟致神经毒性机制中的作用。氟的神经毒理研究以大鼠原代海马细胞为模型以及氟是否对NCAM表达产生影响是本次研究的新颖之处。本研究主要由以下三部分组成:第一部分:原代大鼠海马细胞培养方法的建立和染毒剂量的确定目的:建立原代大鼠海马细胞培养方法,探讨氟对大鼠海马细胞存活率的影响,确定后续实验的氟染毒剂量。方法:原代培养的大鼠海马细胞分别用预设浓度20、40、80、160μg/ml氟化钠染毒24 h,观察不同剂量氟作用后海马细胞细胞形态和细胞存活情况;用MTT法测定海马细胞存活率。结果:20、40μg/ml染毒剂量组与对照组相比,其形态学改变无明显差异,80、160μg/ml染毒剂量组神经元突起减少、变短,160μg/ml染毒剂量组可见细胞崩解。80、160μg/ml染毒剂量组与对照组细胞存活率相比有显著性下降(P<0.05),160μg/ml剂量组细胞存活率<50%,其他染毒剂量组与对照组无显著性差异(P>0.05)。结论:氟可抑制原代培养海马细胞的存活,高浓度的氟可抑制神经元突起的生长,提出氟对发育中海马细胞损伤可能是其神经毒性的作用位点之一。确定后续实验的氟染毒剂量为20、40、80μg/ml。第二部分:氟对原代培养大鼠海马细胞氧化应激、DNA损伤和凋亡的影响目的:利用体外实验方法探讨氟对海马细胞氧化应激的影响以及对原代培养大鼠海马细胞DNA损伤和凋亡的影响。方法:原代培养海马细胞暴露于20、40、80μg/ml氟化钠24 h后,分别检测海马细胞细胞内ROS水平,SOD、GSH-Px活力,GSH、MDA含量,细胞释放LDH活性,DNA损伤以及凋亡的情况。结果:40、80μg/ml剂量组海马细胞细胞内ROS水平、MDA含量、细胞凋亡率、细胞外LDH活性皆明显高于对照组(P<0.05),各剂量组GSH、GSH-Px均显著低于对照组(P<0.05),80μg/ml剂量组SOD活性显著低于对照组(P<0.05),各剂量组彗星Olive尾矩显著高于对照组(P<0.05)。同一剂量组细胞内ROS水平与细胞凋亡率有明显正相关关系(r=0.913,P<0.05)。结论:氟可引起大鼠海马细胞细胞膜损伤,导致海马细胞出现氧化应激、DNA损伤和凋亡,活性氧可能在氟诱导的凋亡中起重要作用。第三部分:氟对原代大鼠海马细胞NCAM mRNA和蛋白表达的影响目的:在基因转录和翻译水平,观察氟对原代大鼠海马细胞NCAM表达的影响,研究氟对NCAM表达的剂量-效应关系。方法:原代培养海马细胞暴露于20、40、80μg/ml氟化钠24 h后,用RT-PCR和Western blot方法分别检测细胞内NCAM mRNA和NCAM各蛋白亚型的表达。结果:40、80μg/ml剂量组细胞NCAM mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05);40、80μg/ml剂量组细胞NCAM-180表达水平显著低于对照组(P<0.05),各剂量组细胞NCAM-140表达水平显著低于对照组(P<0.05),80μg/ml剂量组细胞NCAM-120表达水平显著低于对照组(P<0.05)。结论:氟可引起大鼠海马细胞NCAM mRNA表达水平以及NCAM-180、NCAM-140和NCAM-120蛋白表达水平的下降。