沙蚕属于环节动物门,多毛纲,游走目,沙蚕科,无脊椎动物,广泛分布于日本海与太平洋沿岸,属日本和中国特有品种[1]。近年来,国内外对于沙蚕体内生物活性物质的研究逐渐增多,日本学者从沙蚕中分离出具有生物活性的多肽,这些多肽对环节动物的食管具有较强的收缩作用[2],吉林大学白求恩医学院首次从沙蚕体内分离纯化出蛋白酶(Nereis active protease,NAP)该蛋白酶具有很强的降解纤维蛋白及纤维蛋白原作用[3],并且研究发现沙蚕蛋白酶在体外对多种白血病细胞具有显著抑制作用[4-5]。但目前尚未见沙蚕活性蛋白酶对各种实体肿瘤细胞作用的研究报道。本实验以体外培养的肿瘤细胞株为研究对象,MTT法筛选最佳的肿瘤细胞株,倒置显微镜、透射电镜、HE、AO/EB等方法观察NAP作用于肿瘤细胞后其细胞形态的变化,并通过体外细胞实验Annexin V-FITC/PI双标记法、线粒体膜电位、实时定量PCR、Western blotting蛋白免疫印迹法和体内建立裸鼠荷瘤模型实验研究其诱导细胞凋亡及作用机制,为今后进一步探究奠定基础。研究内容本研究以NAP为实验材料,以体外培养的实体肿瘤细胞为研究对象,用细胞培养液将NAP配制成不同浓度的药,从以下几个方面探讨NAP诱导肿瘤细胞凋亡的作用机理。1、MTT法检测NAP对PC-3、DU-145、H1299、SPC-A-1、95C、A549、SK-BR-3、Hep G2等癌细胞的增殖抑制作用与药物浓度、作用时间的关系,从而选出作用效果最优越的细胞株。2、经倒置显微镜、HE染色法,AO/EB染色法观察NAP作用SPC-A-1、H1299肿瘤细胞后的细胞形态学上的变化。3、在透射电镜下观察不同浓度NAP作用SPC-A-1、H1299细胞24 h后其细胞凋亡过程中的超微结构变化。4、流式细胞仪检测NAP作用于SPC-A-1、H1299细胞24 h后细胞中线粒体的膜电位的变化和细胞的早期凋亡率5、通过Western Blotting法检测NAP作用后SPC-A-1、H1299细胞中Bax、Bcl-2、Caspase 9、细胞色素C、Caspase 3及PARP蛋白的表达情况。6、QC-PCR检测NAP作用于SPC-A-1、H1299细胞24 h后细胞中Bax、Bcl-2的m RNA的表达情况。7、通过建立裸鼠荷瘤H1299模型来检测NAP的体内抗肿瘤作用。研究结果1、MTT检测后的结果显示,NAP对不同肿瘤细胞都有一定的抑制率,其中对肺癌SPC-A-1、H1299细胞抑制效果最好。当不同浓度的NAP作用于人肺癌细胞株SPC-A-1、H1299细胞后表现出明显的增值抑制作用,并呈现出明显的时效和量效关系。2、一定浓度的NAP作用于SPC-A-1、H1299细胞24 h后,倒置显微镜、HE染色可见两种细胞均出现了形态上的变化。与正常细胞相比,药物组细胞出现体积明显变小,形态不规则;胞质出现空泡,核仁数量减小,胞核固缩等细胞凋亡形态学变化。3、AO/EB荧光染色发现NAP作用于两种细胞24 h后,相比于对照组,药物组细胞呈现出不同程度的凋亡状态,低浓度NAP作用下细胞的胞质出现早期凋亡的现象,胞质及胞核发生了变化,胞质出现空泡,并呈现强黄绿色荧光。与低浓度组相比,高浓度组早期凋亡的细胞和晚期凋亡的细胞明显增多,细胞核固缩状更明显,呈现橘红色荧光。4、透射电镜下观察NAP作用SPC-A-1和H1299细胞后的超微结构,对照组中的细胞表面有微绒毛,异染色质少,核仁数少。药物作用后细胞的胞质间出现明显肿胀,在细胞表面,微绒毛消失,异染色质边聚化,胞质内出现空泡。在高浓度药物作用下可见细胞核体积缩小,异染色质边聚明显,通过细胞器形态的变化可以看出药物作用后细胞出现了明显的凋亡现象。5、Annexin V-FITC/PI双染结果显示,SPC-A-1细胞组,当药物浓度从30μg/m L增加到50μg/m L时,早期凋亡率从13.50%增加到22.98%;H1299细胞组,当药物浓度从30μg/m L增加到50μg/m L时,早期凋亡率从11.51%增加到25.92%。6、经流式细胞仪检测NAP作用SPC-A-1和H1299细胞24 h后的线粒体膜电位变化,SPC-A-1细胞组,当药物浓度从30μg/m L增加到50μg/m L时,线粒体膜电位下降的百分率从12.95%增加到25.28%;H1299细胞组,当药物浓度从30μg/m L增加到50μg/m L时,线粒体膜电位下降率从11.01%增加到27.78%。7、Western蛋白印迹结果表明,随NAP浓度的增加,SPC-A-1和H1299细胞中Bcl-2蛋白的表达量都减弱,Bax蛋白表达量却增强显著,Bax/Bcl-2的比率也增加明显,细胞色素C、Cleaved-Caspase 9、Cleaved-Caspase 3、Cleaved-PARP等蛋白水平含量增加。8、体内实验结果表明,沙蚕活性蛋白酶对H1299移植瘤有抑制作用,通过对实体瘤组织Western蛋白印迹实验结果发现,肿瘤组织中Bax蛋白含量增加,Bcl-2蛋白含量减少,我们推测通过Bax/Bcl-2的比率来调控线粒体膜电位的变化,从而启动内源性凋亡的通路,活化了的胱天蛋白酶Caspase 9蛋白进一步激活下游的效应Caspase 3,从而引起细胞凋亡,导致移植瘤变小。研究结论1、NAP有广谱的抗肿瘤效果。2、NAP作用SPC-A-1和H1299细胞后展现出明显的增值抑制效应,并呈现显著的量效及时效关系。3、通过倒置显微镜、荧光显微镜、透射电镜等可以观察到NAP作用SPC-A-1和H1299细胞后展现出凋亡细胞的形态4、经流式细胞仪检测NAP作用SPC-A-1和H1299细胞后的早期凋亡率有明显的增加,同时线粒体膜电位的下载程度也有所增加。5、体外实验表明NAP诱导肺癌细胞凋亡的作用机理可能是通过下调Bcl-2蛋白的表达、上调Bax蛋白的表达,进而诱导线粒体膜电位的下降,促使细胞色素C的转移,进而激发Caspase家族发生级联反应最终导致肿瘤细胞的凋亡,可能为线粒体凋亡途径。6、NAP作用于体内移植瘤的作用机理和体外类似,也是通过上调Bax蛋白的表达,下调Bcl-2蛋白的表达,启动内源性凋亡的通路,活化了的胱天蛋白酶Caspase 9蛋白,活化的Caspase 9激活下游的效应Caspase 3,从而引起细胞凋亡,导致移植瘤变小。