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奶牛乳腺是合成乳汁和分泌乳汁的场所,奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,bMECs)是合成乳汁和分泌乳汁的主要细胞。在奶牛怀孕-泌乳周期中,乳腺上皮细胞的增殖和凋亡处于不同水平的动态平衡,在这个周期中乳腺上皮细胞增殖和凋亡速率具有较大的变化,这种正常的生理变化直接影响或决定奶牛泌乳期的长短和泌乳量的高低。奶牛的泌乳量还受bMECs数量和活力的影响。同时,泌乳早期乳腺的发育也影响泌乳上升阶段的泌乳量。因此,研究乳腺上皮细胞增殖和乳腺发育的机制具有重要意义。Kisspeptin(Kp)是由KISS1基因编码的一类神经肽类激素,其前体可裂解成含54个氨基酸的生物活性短肽,即Kp-54。Kp-54进一步裂解可形成Kisspeptin-10(Kp-10)等短肽,Kp家族的短肽可与G蛋白偶联受体54(G protein-coupled receptor 54,GPR54)特异性结合。研究发现KISS1/GPR54系统主要参与调节细胞增殖、青春期启动、性腺激素的分泌以及生殖活动等重要的生命活动。那么,Kp-10是否可能介导GPR54及下游信号分子调节乳腺上皮细胞的增殖,进而调节乳腺发育?目前海内外尚未见与此相关的研究报道。因此,本实验首先明确Kp-10对bMECs增殖的影响,接着通过添加Kp-10抑制剂研究Kp-10影响bMECs增殖的具体机制。为了进一步接近体内环境,通过选用体外培养奶牛乳腺组织块的方法进一步验证细胞实验研究结果。在研究Kp-10影响bMECs增殖后,通过C57雌鼠在体实验研究Kp-10对青春期乳腺发育的影响。首先,选用CCK-8技术检测不同浓度Kp-10对bMECs增殖的影响,结果表明10 nM和100 nM的Kp-10能够显著促进bMECs增殖。在后续实验中,选用100 nM的Kp-10作为实验浓度。通过流式细胞仪检测细胞周期、RT-PCR检测P21基因表达、Western blot检测Cyclin D1和Cyclin D3蛋白表达。结果表明100nM的Kp-10能够促进bMECs从G1期向G2期和S期转变、抑制P21基因表达及促进Cyclin D1和Cyclin D3蛋白表达。GPR54是Kp-10的受体,通过Western blot检测GPR54蛋白表达,结果表明Kp-10促进GPR54蛋白表达。为了进一步研究Kp-10促进bMECs增殖的机制,通过选用Kp-10的抑制剂Peptide-234研究Kp-10是否通过激活GPR54促进bMECs增殖,结果表明Peptide-234抑制了Kp-10促进的bMECs增殖;进一步研究发现Kp-10能激活bMECs中蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of Rapamycin,mTOR)、细胞外信号调节激酶(Extracellular regulated-protein kinase 1/2,ERK1/2)信号通路。分别选用AKT、mTOR、ERK1/2抑制剂处理后均能抑制Kp-10促进bMECs增殖的作用,说明Kp-10能够通过激活AKT、mTOR、ERK1/2信号通路促进bMECs增殖。同时,Kp-10能够激活视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma,Rb)、促进E2F1的蛋白表达、减少Rb和E2F1形成的复合物以及促进E2F1靶基因的表达。为了进一步接近体内环境,我们通过培养奶牛乳腺组织块来验证细胞实验研究结果,结果表明Kp-10能够激活奶牛乳腺组织块AKT、mTOR和ERK1/2信号通路,此外Kp-10能够促进乳腺组织块中Cyclin D1、Cyclin D3和增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)表达,抑制GPR54后抑制了Kp-10的上述作用。接着,分别选用AKT、mTOR和ERK1/2抑制剂处理后能够抑制Kp-10促进的乳腺组织块中Cyclin D1、Cyclin D3和PCNA蛋白表达。最后,我们通过对出生30 d的C57雌鼠腹腔注射100μL浓度为6μM的Kp-10,每2 d注射一次、连续注射10次。实验鼠21 d后断颈处死,取乳腺进行全组织染色,结果表明Kp-10能够促进乳腺导管分支形成。Western blot检测Cyclin D1、Cyclin D3和PCNA蛋白表达,结果表明Kp-10能够促进鼠乳腺Cyclin D1、Cyclin D3和PCNA蛋白表达。以上研究结果表明Kp-10能够促进乳腺上皮细胞增殖和乳腺发育。