幽门螺杆菌Tipα蛋白经C23/NF-κB途径诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-8

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目的:观察幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)肿瘤坏死因子α诱导蛋白(Tipα)诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-8的分子机制。方法:体外培养人单核细胞系THP-1,用佛波脂(PMA)诱导其分化为巨噬细胞后,采用30~200μg/ml的Tipα刺激4h,实时定量PCR(real time PCR)检测核仁素(C23)和Toll样受体4(TLR4)m RNA的表达;分别采用C23和TLR4 si RNA干扰巨噬细胞后,观察其对Tipα诱导TNF-α和IL-8的影响;采用5μg/m L衣霉素预处理细胞抑制N-糖链合成,随后用Tipα刺激24h,观察其对TNF-α和IL-8分泌的影响;分别采用C23和Tipα抗体沉淀蛋白,随后分别采用Tipα和C23抗体行Western blot分析;采用C23 si RNA干扰其表达后,Western blot分析IκB表达水平以及细胞核中p65含量;采用蛋白酶体抑制剂MG-132处理细胞,ELISA检测其对TNF-α和IL-8的影响。结果:(1)Real time PCR结果显示,30~200μg/ml Tipα处理巨噬细胞4h后,C23的m RNA水平明显增高,且随着Tipα剂量的增加,m RNA表达水平有增高的趋势。TLR4m RNA水平在Tipα处理前后无明显变化;(2)ELISA结果显示C23 si RNA转染后,Tipα刺激后TNF-α和IL-8显著降低,而TLR4 si RNA转染对TNF-α和IL-8分泌无明显影响;(3)5μg/ml衣霉素预处理8h后,ELISA结果显示Tipα刺激后TNF-α和IL-8明显低于未处理组;(4)采用C23抗体沉淀蛋白后,可检测到明显的Tipα条带。同时,预先使用Tipα抗体沉淀蛋白,也可检测出C23条带;(5)Tipα处理巨噬细胞后,细胞内IκB水平明显降低。C23 si RNA干扰其表达后,IκB降解受到抑制;Tipα可增加细胞核内p65的含量,而C23 si RNA干扰后,细胞核内p65含量明显降低;(6)巨噬细胞经10μmol/L MG-132预处理4h,Tipα诱导的TNF-α和IL-8含量明显降低。结论:(1)C23可能是Tipα的受体;(2)Tipα经C23/NF-κB通路诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-8。
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