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氨基酰-tRNA合成酶(AaRS)催化tRNA的氨基酰化反应，为蛋白质合成提供原料。合成正确的氨基酰-tRNA是蛋白质合成的质量控制的关键步骤。为了确保遗传信息被正确传递，AaRS在进化的过程中获得了多种编校机制来保证催化反应的精确性。AaRS催化反应的专一性不仅涉及到AaRS，也与tRNA有关。亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)和tRNALeu的研究通常在体外实验中进行。在本研究中，我们分别敲除了酵母tRNALeu(UAG)和tRNALeu(GAG)，构建了两株缺陷菌株tl(uag)-Δ1-3和tl(gag)-Δ1。我们发现酵母tRNAL。u(GAG)不是酵母生长必需的tRNA，而酵母tRNALeu(UAG)可以识别四种CUN密码子，为酵母生长必需。同时首次发现酵母用“超摆动”(superwobbling)阅读亮氨酸密码子。通过化学诱变tRNALeu(UAG)基因，我们在菌株tl(uag)-Δ1-3建立了随机突变库，在基因水平上筛选并发现了若干影响tRNALeu(UAG)转录、与LeuRS的氨基酰化和编校功能有关的关键碱基。我们还利用tl(uag)-Δ1-3通过基因定点突变得到带有修饰碱基的酵母tRNALeu(UAG)变种，进行体外tRNALeu功能研究，得到的体内和体外数据相符。该研究不仅丰富了对酵母tRNALeu功能的认识，也为进一步研究酵母tRNA的结构和功能关系提供了很好的研究系统。 氨基酰化反应的精确性依赖于AaRS对于tRNA的正确识别。tRNALeu有一个长可变茎环，属于第二类tRNA。我们实验室已经通过足迹保护(footprint)方法研究了超嗜热菌Aquifex aeolicus的亮氨酰-tRNA合成酶(AaLeuRS)对相应tRNALeu的保护位点。为了进一步研究AaLeuRS和其AatRNALeu的相互作用机理，以及同属第一类AaRS a亚类的LeuRS和ValRS对各自tRNA识别方式的异同，我们构建了一系列AatRNAVal向AatRNALeu的个性扭转突变体。我们的研究结果表明，AatRNALeu长可变茎环，D茎环和T茎环之间的协调作用对于维持AatRNALeu的三级结构，保证AaLeuRS的精确识别至关重要，而AatRNAVal和AatRNALeu三级结构的差别决定了对应的AaRS的专一性。对D茎环的精确分析表明，AatRNALeu三级结构的发挥可能更依赖D环和T环之间的氢键直接相互作用，而与D茎的关系不大，D环的大小并不直接参与酶的相互识别，而D环上的关键核苷酸氢键配对提供的作用力是三级结构形成的基础。 LeuRS一级序列的催化活性中心中，包含一个被称为连接肽1(connective peptide1，CP1)的插入序列。在形成三级结构时，CP1折叠成编校结构域。催化结构域和编校结构域通过CP发夹结构相连接。CP发夹结构由反平行的β折叠组成，具有相当的柔性。LeuRS催化功能的发挥依赖于CP发夹结构带动CP1转动一定角度，以使酶形成合适的构象。我们构建了人细胞质LeuRS(hcLeuRS)的CP发夹结构的缺失突变体，发现CP发夹结构对于氨基酸活化和氨基酰化功能的发挥至关重要，而几乎不影响酶的转移后编校功能的发挥。尽管三界生物的CP发夹结构都很保守，但只有亲缘关系较近的酵母胞质LeuRS(ycLeuRS)的CP发夹结构可以拯救hcLeuRS CP发夹结构的缺失。最后的精细定点突变结果显示，CP发夹结构上保守的氨基酸残基的柔性和电荷性质决定了酶的功能的发挥，暗示CP发夹结构一方面影响酶的折叠，另一方面直接参与酶催化反应。体内补偿实验结果和体外实验结果基本吻合。