论文部分内容阅读
在酸性条件下青霉素酰化酶能催化p-内酰胺母核与D-氨基酸类似物缩合生成新的p-内酰胺类抗生素,因此青霉素酰化酶是种重要的医药工业用酶。合成p-内酰胺类抗生素的传统的化学方法具有反应条件要求高、反应步骤多、成本高、收率低等缺点,而且还要用PCl5、吡啶、NOCl等高毒性试剂,极易造成环境污染,对比之下,酶法合成方法具有生产工艺过程简单、环境污染小、反应条件温和、绝对专一性等优点,并且生产成本较低。因此,利用微生物发酵法生产青霉素酰化酶具有重大的现实意义。本文以重组大肠杆菌为实验菌种,对青霉素酰化酶发酵条件的优化、分批发酵动力学、青霉素酰化酶的固定化和酶法合成头孢羟氨苄等进行研究,实验结果如下：青霉素酰化酶发酵条件的优化单因素实验确定的最适蛋白胨浓度、最适甘油浓度、最适发酵温度、最适发酵pH和最适诱导物IPTG浓度的范围分别为15～25g/L、15～20g/L、28～32℃、pH6.5～7.5和50μg/mL。采用Box-Behnken实验设计优化重组大肠杆菌合成青霉素酰化酶的发酵条件,然后用SAS 8.1统计分析软件对实验数据进行统计分析,得出最适发酵条件为：最适蛋白胨浓度为23 g/L,最适甘油浓度为23 g/L,最适发酵pH为pH7.2,在最适发酵条件下青霉素酰化酶的平均酶活力为3989.46 U/L,比单因素实验提高了6.5%。分批发酵动力学利用5L发酵罐放大重组大肠杆菌合成青霉素酰化酶的发酵过程,依据Luedeking-piret方程及Logistic方程,利用Origin 8.0绘图软件对重组大肠杆菌合成青霉素酰化酶的发酵实验数据非线性拟合,构建分批发酵合成青霉素酰化酶的菌体生长动力学模型、青霉素酰化酶合成动力学模型和底物消耗动力学模型,分别如下所示：①菌体生长动力学模型：②合成青霉素酰化酶动力学模型：③底物消耗动力学模型：构建的模型可以很好地模拟分批发酵重组大肠杆菌合成青霉素酰化酶的实时动态过程,为工业上生产青霉素酰化酶提供参考的依据。青霉素酰化酶的固定化采用单因素实验确定影响青霉素酰化酶固定化的因素的最适范围,采用Box-Behnken实验设计对最适范围进行优化,结果表明最适固定化条件为：温度26℃、pH8.2、时间31 h、载体用量0.11 g/mL,在最适固定化条件下固定化酶的平均酶活力和酶活力回收率分别为130.84 U/g、60.72%。酶法合成头孢羟氨苄对酶法合成头孢羟氨苄的温度、pH、侧链与母核摩尔比、投酶量和母核浓度等条件进行优化,实验结果表明,在温度20℃、pH6.5、摩尔比1.2：1、投酶量20 g、母核浓度13%的工艺条件下,反应转化率达到99.47%,在最适条件下转化反应重复进行100批次,平均转化率高达98.32%。