论文I姜黄素对实验性自身免疫性重症肌无力的治疗研究研究背景及目的：重症肌无力(Myasthenia gravis, MG)是一种经典自身免疫性疾病,主要累及神经肌肉接头处突触后膜上乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor, AChR),导致神经肌肉处传导功能障碍进而产生肌肉无力,疾病过程需要AchR受体抗体介导、细胞免疫依赖、补体参与。临床上主要表现为部分或全身的骨骼肌易疲劳、波动性肌无力,活动后症状加重,经休息或服用抗胆碱酯酶药后症状可缓解。目前该疾病的治疗方法多是应用免疫调节药物,通常需要长期服用,且具有一定的副作用,这促使我们需要寻找一种毒副作用小且安全有效的治疗药物。研究发现从电鳐器官中提取AChR,通过皮下免疫Lewi s大鼠能够成功地建立实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG)动物模型。最新实验研究,皮下注射大鼠来源的AChRα亚基97-116肽段(R97-116)也可以成功地诱导相似的抗原特异性免疫应答模型,该肽段打破了抗原的耐受性,诱导T细胞自身活化及特异性抗体的产生。所以R97-116肽段诱导的EAMG模型常被用做研究与探讨MG的理想动物模型。姜黄属多年生草本植物姜黄的干燥梗茎,现代药理分析其主要成分包含姜黄素(curcumin)、脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素等,其中姜黄素是最重要的活性成分。姜黄素做为近年来的研究热点,发现其具有广泛的药理作用,如抗癌作用、抗炎作用、抗氧化、神经系统保护作用、抗动脉粥样硬化、降血脂功能等等。众多研究已证实姜黄素对人类及动物免疫性疾病的免疫调节功能,例如：在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE)中发现,姜黄素能够可以抑制TH1和TH17型细胞反应并降低TNF-α的表达；在实验性自身免疫性神经炎(experimental autoimmune neuritis, EAN)中,姜黄素直接抑制CD4+T细胞中IFN-γ的分泌,减少了坐骨神经中炎症细胞的浸润；在炎性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)研究中,发现中姜黄素可促进Th细胞由Thl型向Th2型转化。但到目前为止,还没有关于姜黄素对于重症肌无力疾病的相关报道,因此,我们在EAMG大鼠发病的起始阶段给予姜黄素治疗,探讨其对EAMG大鼠的临床症状、Th细胞分化、细胞因子、抗体水平、NK细胞、B10细胞的影响。研究目的：探讨姜黄素对实验性自身免疫性重症肌无力的免疫调节作用。研究方法：1.建立EAMG模型及临床分级选择健康、SPF级别、雌性Lewis大鼠,一般6-8周龄,体重160-180 g。用H37Ra株热灭活结核杆菌和不完全弗氏佐剂溶解人工合成的大鼠来源的AChR-α亚基97-116肽段合成免疫乳剂,每只大鼠在双后足垫皮下注射200μ1乳剂,然后在免疫11天后于每只大鼠背部再次免疫1次,作为强化免疫。每间隔一天采用Lennon临床评分量表对每只大鼠进行临床分级和称重,直至发病高峰第45天,这个过程需要采用双盲法。2. EAMG大鼠的分组与治疗将18只Lewis大鼠每6只一组,随机分成姜黄素小剂量治疗组(50 mg/kg)和姜黄素大剂量治疗组(100 mg/kg)和EAMG对照组(同体积PEG)。于EAMG大鼠发病第11日起开始,隔日给予姜黄素及等体积的PEG腹腔注射,直至大鼠发病高峰期第45天。3.制备淋巴结单个核细胞(mononuclear cells, MNC)在EAMG大鼠发病高峰期,无菌操作下分离、获取各组大鼠腹股沟淋巴结,通过研磨过滤、离心,制备MNC悬液,并用细胞计数板计数,通过计算,最终获取细胞浓度为2×10。个细胞／ml的细胞悬液。4.流式细胞术检测淋巴结单个核细胞中的细胞因子取大鼠腹股沟淋巴结制备单细胞悬液,加入细胞刺激阻断剂,培养4h后收集细胞,标记+IL-4+(Th2)、CD4+IL-17+(Thl7)和CD4+Foxp3+(Treg)细胞,及细胞因子TNF-α、IL-10,用流式细胞仪检测。5.通过ELISA法检测抗R97-116 IgG抗体水平和抗体亲和力在EAMG发病高峰期处死大鼠,吸取心脏血静置离心,获取血清,通过ELISA法检测不同组大鼠血清中抗R97-116 IgG抗体各亚型的水平和抗体亲和力。6.流式细胞术检测淋巴结单个核细胞中的NKR-P1+细胞(natural killer cell receptor protein 1 positive cells)取大鼠腹股沟淋巴结制备单细胞悬液,加入CD3、CD161抗体检测NK细胞与NKT细胞,用流式细胞仪检测。7.检测淋巴结单个核细胞中调节性B细胞(regulatory B cells, Breg)取大鼠腹股沟淋巴结制备单细胞悬液,加入CD19、IL-10抗体检测B10细胞,用流式细胞仪检测。8.通过统计学分析各组大鼠数据通过统计分析软件SPSS17.0分析各组资料数据,数据结果以均值±标准差(standard deviation, SD)表示。两组间数据比较应用独立样本t检验,三组间数据比较应用单因素方差分析(one-factor analysis of variance, ANOVA)当P<0.05时,视差异有统计学意义。研究结果：1.姜黄素可缓解EAMG大鼠的症状与未经治疗的EAMG对照组相比,姜黄素治疗的EAMG大鼠临床症状明显缓解。与且EAMG对照组相比,大剂量姜黄素组在发病后第23天,27天,29天,33天,35天,37天,39天,41天,43天和45天均明显减轻了大鼠的临床症状。小剂量姜黄素组在发病后第29天,31天,43天and 45天与对照组相比明显减轻了临床症状。2.姜黄素抑制EAMG大鼠淋巴结单个核细胞上CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达与EAMG对照组相比,大剂量姜黄素治疗组中大鼠淋巴结单个核细胞上CD80及MHC-II的表达均显著降低。两组姜黄素治疗组的淋巴结单个核细胞上CD86的表达与EAMG对照组相比均明显降低。3.姜黄素对EAMG大鼠淋巴结单个核细胞中细胞因子的影响用流式细胞术检测大鼠淋巴结单个核细胞中的CD4+IFN-γ+(Thl)细胞、CD4+IL-4+(Th2)细胞、CD4+IL-17+(Th17)细胞和CD4+Foxp3+(Treg)比例发现,姜黄素治疗后Th1、Th2、Th17、Treg的细胞比例有明显变化,抑制了疾病的免疫进展。另外,用流式细胞术检测各组淋巴结单个核细胞中IFN-γ、TNF-α、IL-10及1L-17细胞因子,与EAMG对照组相比,两组姜黄素治疗组大鼠MNC中的IFN-γ显著降低,IL-10的表达明显增加。小剂量姜黄素治疗组与对照组相比,IL=17和TNF-α表达显著下降；大剂量治疗组的IL-17和TNF-α表达亦下降,但没有统计学差异。4.姜黄素上调了淋巴结单个核细胞中NK细胞与NKT细胞的数量姜黄素治疗后,高剂量治疗组的NK (CD3-CD161a+)细胞的数量与EAMG对照组相比明显升高。与对照组相比,两组姜黄素治疗后NKT (CD3+CD161a+)细胞数量显著升高。5.姜黄素的上调了淋巴结单个核细胞中B10细胞的数量姜黄素治疗后,与EAMG对照组相比,大剂量姜黄素治疗组中B10 (CD19+IL10+)细胞数量显著升高,小剂量姜黄素治疗组B10细胞亦升高,但没有统计学差异。6.姜黄素治疗增加了抗R97-116抗体IgGl的表达并且降低了R97-116 IgG抗体的亲和性与EAMG对照组相比,姜黄素治疗后对EAMG大鼠血清中抗R97-116 IgG抗体的水平无明显影响,但显著降低了抗体的亲和性。小剂量姜黄素治疗组抗R97-116抗体IgG1的表达显著增加,大剂量治疗组抗R97-116抗体IgGl的表达也有升高,但无统计学意义。结论：1.姜黄素治疗有效缓解了EAMG大鼠的临床症状。2.姜黄素治疗抑制了EAMG大鼠T细胞表面共刺激因子CD80、 CD86和MHCclass-II的表达。3.姜黄素治疗抑制了促炎细胞因子IL-17、IFN-γ、TNF-α的产生,上调了抑炎细胞因子IL-10的表达,促进Th细胞由Thl/Th17型向Th2/Treg型分化。4.姜黄素治疗增加了EAMG大鼠体内NK细胞和NKT细胞的数量。5.姜黄素治疗促进B细胞分化为B10细胞。6.姜黄素治疗增加了EAMG大鼠体内保护性抗体IgGl的数量并且减少病理性抗体的总亲和力。论文II新型烟碱对实验性自身免疫性神经炎的治疗研究研究背景及目的：格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome, GBS)为急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病,可引起神经肌肉麻痹,其中急性炎症性脱髓鞘多发性神经病(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy, AIDP)为最常见类型。AIDP是一种自身免疫性疾病,主要由CD4*T细胞介导、累及外周神经系统(Peripheral nervous system, PNS)。实验性自身免疫性神经炎(Experimental autoimmune neuritis, EAN)是目前公认的研究人类格林巴利综合征的理想动物模型,可通过免疫同种抗原(BPM、PO等)在易感动物中成功地诱导产生。新型烟碱,一种与尼古丁化学结构极其相似的烟草生物碱,半哀期比尼古丁长,但毒性与成瘾性都远低于尼古丁,在许多疾病研究中显示出优秀的抗炎能力和治疗效果,例如在阿茨海默症中,新型烟碱能通过血脑屏障并抑制脑组织NF-kb通路活化；在实验性变态反应性脑脊髓炎动物模型中,新型烟碱抑制Thl/Thl7型细胞因子；在自身免疫性甲状腺炎动物模型中,新型烟碱促进Th2细胞因子分泌并减轻甲状腺免疫球蛋白的抗体反应。但至今还未有关于新型烟碱治疗EAN或人类GBS的相关报道,因此,我们给予EAN大鼠新型烟碱治疗,并研究其对大鼠自身免疫调节作用的机制。结果发现新型烟碱可以改善EAN疾病的临床症状,减少了坐骨神经炎性细胞的浸润,下调了细胞因子IL-10与IFN-γ的表达,上调了Treg细胞的表达,增加的NK细胞的数量。综上结果表明,新型烟碱有效的缓解了自身免疫性神经炎模型大鼠的疾病症状,为治疗格林-巴利综合征提供了新选择。研究方法：1.EAN模型的建立及临床评分从新鲜牛尾中提取抗原BPM,采用健康、SPF级别、6-8周雌性lewis大鼠,150-170g,将BPM溶于H37Ra株热灭活结核杆菌和不完全弗氏佐剂中,充分混匀制备成免疫溶剂。大鼠双后足垫皮下注射免疫溶剂造模,每只大鼠用量为200μl。注射当天定为第0天,双盲法临床评分,每日称重,直至发病高峰第16天。2.动物分组及药物干预将15只大鼠随机分为三组,每组5只且体重平均数基本一致。三组分别为小剂量治疗组(2 mg/kg)、大剂量治疗组(20 mg/kg)和EAN对照组(同体积蒸馏水)。治疗组于免疫后5第天开始用灌胃法给予新型烟碱药物治疗,直至免疫后第16天。对照组灌胃给予相同体积的蒸馏水。3.组织病理学检测在发病高峰期水合氯醛麻醉后脱臼处死大鼠,取坐骨神经置于10%多聚甲醛中固定,石蜡包埋后常规切片,然后依次经脱蜡、水化、苏木素染色、0.5%伊红液染色、脱水、透明、封片等步骤处理。显微镜下观察坐骨神经中炎性细胞的浸润情况,并计数统计。4.制备淋巴结单个核细胞(mononuclear cells, MNC)无菌操作下分离大鼠腹股沟淋巴结,用玻璃棒研磨、细胞滤器过滤、离心后制备单个核细胞悬液,细胞计数板计数后调整获得细胞浓度为2×10。个细胞/ml的细胞悬液。5.流式检测Treg细胞的比例取调整好浓度的淋巴结MNC悬液,加入标记的CD25抗体和CD4抗体,孵育30min后加入固定破膜工作液,避光孵育过夜,次日后洗涤细胞加入PE-cy5标记的Foxp3抗体静置30min后,重恳过滤细胞后上机流式细胞仪检测。6.流式细胞术检测MNC的细胞因子取大鼠腹股沟淋巴结制备好淋巴结MNC悬液,经过洗涤、固定、破膜后,加入细胞刺激阻断剂,培养4 h后收集细胞,分别加入FITC标记的IFN-γ、PE标记的IL-10及FITC标记的IL-17细胞因子,孵育、重悬、过滤后,用流式细胞仪上机检测。7.流式细胞术检测NK细胞取大鼠腹股沟淋巴结制备好的单细胞悬液,分别加入CD3、CD161抗体标记检测NK细胞,经过孵育、重悬、过滤后,用流式细胞仪上机检测。8.通过统计学分析各组大鼠数据通过统计分析软件SPSS17.0分析各组资料数据,数据结果以均值±标准差(standard deviation, SD)表示。两组间数据比较应用独立样本t检验,三组间数据比较应用单因素方差分析(one-factor analysis of variance, ANOVA),当P<0.05时,视为组间差异有统计学意义。研究结果：1.三组大鼠的发病症状与临床评分三组老鼠均在第16天达到发病高峰,与对照组相比,两组新型烟碱治疗组大鼠的临床症状明显改善.与对照组相比,大剂量烟碱治疗组的临床评分从免疫后的第11天到16天均显著降低。小剂量烟碱治疗组的临床评分也有降低,在免疫后第11天、第14天、第15天、第16天与对照组相比具有统计学差异。两组治疗组间评分无明显差异。2.新型烟碱治疗减少了EAN大鼠坐骨神经中炎性细胞浸润的情况与EAN对照组相比,大剂量烟碱治疗组(20mg/kg)和小剂量烟碱治疗组(2mg/kg)大鼠坐骨神经均可见炎性细胞浸润减少,且大剂量治疗组与小剂量治疗组相比可见更少的炎性细胞浸润。3.新型烟碱抑制了EAN大鼠IL-10、IFN-y的表达用流式细胞术检测大鼠淋巴结单个核细胞中的IL-10、IFN-γ、IL-17细胞因子的表达。与EAN对照组相比,两组新型烟碱治疗组的IL-10表达均下降,大剂量新型烟碱治疗后细胞因子IFN-γ表达明显下降,小剂量组IFN-γ表达亦下降但没有统计学意义。两组新型烟碱治疗后IL-17表达均下降,但与对照组相比没有显著统计学差异。4.新型烟碱治疗上调了淋巴结恻C中Treg细胞的表达用流式细胞术检测大鼠淋巴结单个核细胞中Treg细胞的表达情况。结果显示,与EAN对照组相比,大剂量烟碱治疗组上调了CD4+Foxp3+细胞的数量,小剂量烟碱治疗组中CD4+Foxp3+细胞数量亦上升,但没有统计学差异。5.新型烟碱治疗的增加了MNC中NK细胞的数量用流式细胞术检测大鼠淋巴结单个核细胞中NK细胞的表达情况。与EAN对照组相比,大剂量新型烟碱治疗组CD3+CD161a+(NK)细胞数量增加,小剂量烟碱治疗组中NK细胞有升高趋势,但没有统计学差异。结论和意义：本研究发现,给予EAN大鼠新型烟碱治疗后可有效缓解大鼠的临床症状,药物通过抑制坐骨神经炎性细胞的浸润,降低淋巴结MNC的CD80的表达,上调淋巴结单个核细胞中Treg细胞的数量,抑制IL-10与IFN-γ细胞因子的表达,增加的NK细胞数量几个方面发挥了免疫调节作用,本实验为临床上治疗人类GBS提供了一种新策略和新方法。