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研究背景及目的肺纤维化是一种病因复杂的疾病,以肺成纤维细胞过度增殖、细胞外基质过度沉积为主要特征。其发病机理被认为与各种细胞因子、生长因子之间的平衡失调有关。在肺纤维研究中,细胞因子网络始终是人们的研究热点,其中转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)被认为是导致纤维化的重要因子。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)作为TGF-β的下游因子,可能是肺纤维化过程中的一个关键的调节因子。CTGF是即刻早期基因CCN (CTGF, cyr61, nov)家族成员之一。为富含半胱氨酸的多肽。在TGF-β诱导下,可由多种细胞分泌合成,它也具有促细胞增殖和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)合成等作用,因此CTGF已成为这一研究领域中新的热点。至今,CTGF在肺纤维化中的作用知之甚少,本论文即探讨CTGF在肺成纤维细胞中的生成与ERK1/2途径的关系。姜黄素(Curcumin )是从姜黄中提取的一种活性成分,现代药理研究认为姜黄素具有抗炎、抗凝、降脂、抗氧化和抗肝纤维化等多种作用。为此我们推测,姜黄素对肺纤维化也具有预防和治疗的作用。前期的整体实验研究已经证明了这一点。研究方法及结果1文中第一部分,我们探讨了姜黄素对体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5)增殖、胶原表达和周期分布的影响,方法:体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),用姜黄素处理,分为①正常对照组,②10μmol/L姜黄素组,③20μmol/L姜黄素组,④30μmol/L姜黄素组,⑤40μmol/L姜黄素组,⑥50μmol/L姜黄素组,⑦60μmol/L姜黄素组。在37℃继续培养24 h后,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖情况,用天狼猩红染色法测定细胞内胶原的表达,用流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果显示,一定浓度姜黄素能抑制人胚肺成纤维细胞的增殖和胶原的增加,并使细胞周期停滞在G1期,提示姜黄素可能通过抑制人胚肺成纤维细胞的增殖来减少细胞外基质积聚,从而发挥其抗肺纤维化的作用。2文中第二部分,我们建立了肺纤维化体外细胞模型.方法::体外培养人胚肺成纤维细胞,分成四组①正常对照组②TGF-β刺激组③CTGF刺激组④TGF-β+CTGF刺激组,Western-blotting检测胶原Ⅰ、胶原Ⅲ及FN的变化,RT-PCR检测α-SMA的表达水平,酶联免疫吸附实验检测培养液中TIMP-1表达量,天狼猩红染色,检测总胶原的表达,MTT检测细胞的增殖。结果显示,TGF-β联合CTGF能显著诱导胶原Ⅰ、胶原Ⅲ及FN的表达,并且能活化成纤维细胞为肌成纤维细胞促进细胞外基质的沉积,由此可知,TGF-β联合CTGF刺激人胚肺成纤维细胞建立的细胞模型能非常全面的反映肺纤维化过程中成纤维细胞的增殖和细胞外基质的沉积。3文中第三部分,我们讨论了TGF-β刺激下CTGF的生成情况及与ERK1/2途径的关系方法:体外培养人胚肺成纤维细胞,不同浓度的TGF-β刺激,Western-blotting检测CTGF的表达,体外培养人胚肺成纤维细胞,10 ng/ml TGF-β分别刺激30min、1h、3h、6h、12h、24h。酶联免疫吸附实验检测各组细胞中的p- ERK1/2和total- ERK1/2,结果显示,(1)TGF-β可剂量依赖性诱导CTGF的生成,(2)TGF-β可激活ERK1/2信号途径,(3)阻断剂组CTGF的表达也下降,4文中第四部分,我们讨论了姜黄素对CTGF的表达和ERK1/2途径的影响。方法:体外培养人胚肺成纤维细胞分成五组,①正常对照组②TGF-β刺激组③阻断剂预处理,TGF-β刺激组④TGF-β+40umol/L姜黄素⑤TGF-β+60umol/L姜黄素,免疫组化和western-blotting检测每组中CTGF的蛋白的表达,RT-PCR检测检测每组中CTGF mRNA的水平,western-blotting检测各组细胞中p- ERK1/2和总- ERK1/2表达水平。结果显示,姜黄素可抑制CTGF的生成,并能抑制和延缓. p- ERK1/2和总- ERK1/2的表达,故推测,ERK1/2途径参与了CTGF的生成,而姜黄素能抑制两者的表达。结论1姜黄素能体外抑制成纤维细胞的增殖,降低细胞外基质的含量,从而发挥预防和治疗肺纤维化的作用。2 TGF-β联合CTGF孵育成纤维细胞建立的肺纤维化体外细胞模型可较好的反映肺纤维化过程中成纤维细胞的活化增殖和细胞外基质沉积的变化。3 TGF-β可部分通过ERK1/2途径诱导CTGF的表达。4姜黄素可能部分通过抑制ERK1/2途径抑制CTGF的表达。