本文采用手性柱，建立了胶囊中磷酸苯丙哌林对映体含量测定的高效液相色谱法。首先，采用了3、5-二甲基苯异氰酸酯衍生化的环糊精手性柱，在正相高效液相色谱条件下，以标准磷酸苯丙哌林对映体为对照品，考察了流动相组成、柱温和流速对分离的影响，确定了最佳色谱分离条件。其次，进行了胶囊中磷酸苯丙哌林对映体含量测定的方法学研究。为了确定磷酸苯丙哌林对映体经过手性柱分离后两峰的R、S构型，采用化学拆分剂L-（+）-二苯甲酰基酒石酸拆分制备了左旋磷酸苯丙哌林对映体，考察了拆分剂的选择、拆分溶剂的种类、用量、成盐过程中反应条件对拆分的影响。结果证明，经过化学拆分法制备出的左旋磷酸苯丙哌林为白色鳞片状化合物。测得其沸点和比旋光度与文献值相吻合，其光学纯度高达97.5%，收率为95.4%。采用正乙烷：无水乙醇：三氟乙酸（60：40：0.1）作为流动相，检测波长为210nm，柱温为25℃，流速为1mL/min时，磷酸苯丙哌林对映体获得了最佳分离。S-（-）-磷酸苯丙哌林先于R-（+）-磷酸苯丙哌林被检出。磷酸苯丙哌林的可检测线性范围为40-200μg/mL，R，S-（±）-磷酸苯丙哌林的线性相关系数分别为r=0.9998和0.9996，回收率分别为98.45%和98.38%，RSD（n=6）分别为0.66%和0.79%，检测限为2ng/mL。该方法精密性好，准确性高，稳定性好。可用于胶囊中磷酸苯丙哌林对映体的定量分析，也可为其它剂型中磷酸苯丙哌林对映体的含量测定提供参考。