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毛白杨是中国特有的一个杨树品种,它分布广泛,生长迅速,树干坚实挺拔,易于扩繁,不仅是造林绿化的优良树种,也是我国非常重要的资源林木。随着2006年杨树基因组测序的完成,杨树已经成为林木研究的模式植物,并广泛应用于次生壁发育尤其是木质素合成的研究。通过对拟南芥、桉树、火炬松等物种中与次生壁合成相关转录因子的序列分析,发现拟南芥的AtMYB61转录因子不仅调控了次生壁中木质素的生物合成,也特异地在气孔中表达,参与了不同光周期下气孔的开闭,气孔的开闭与植物水分散失和植物抗旱密切相关。该类转录因子是否同时调控了次生壁的生物合成和抗旱胁迫呢?目前尚不清楚。为此,我们从毛白杨中克隆了AtMYB61的同源基因——PtoMYB170,通过基因超量表达、基因敲除技术等方法,在毛白杨中深入研究了PtoMYB170转录因子在次生壁合成调控过程中的具体功能,并在拟南芥中进行了抗旱试验,证明了该因子在干旱胁迫中的调控作用。具体研究结果如下:(1)生物信息学分析发现,PtoMYB170转录因子具有保守的R2R3结构域和核定位信号序列,与已报道的次生壁合成相关MYB转录因子的进化关系较近,推测其可能参与了次生壁生物合成的调控。(2)酵母的转录激活实验和亚细胞定位试验表明,PtoMYB170是一个定位于细胞核的转录激活子。(3)荧光定量PCR结果显示,PtoMYB170基因在毛白杨茎中表达量最高,暗示其可能参与了毛白杨次生壁的生物合成。(4)将超量表达PtoMYB170基因的转基因植株与野生型对比发现,前者叶片卷曲、深绿、植株发育矮壮。而敲除PtoMYB170基因的杨树则表现出植株矮小、弯曲的症状,暗示PtoMYB170转录因子可能参与了杨树次生壁的生物合成调控。(5)进一步对转基因材料的叶片和茎段进行解剖学观察和组织化学染色,发现超量表达PtoMYB170基因的株系叶片及茎中木质化的程度明显高于野生型材料;而敲除PtoMYB170株系叶片及茎的木质素积累明显少于野生型。激光共聚焦显微镜检测木质素在叶片及茎中自发荧光证实了组织染色结果。而且次生壁会有一定程度的塌陷。扫描电镜观察发现,超量表达PtoMYB170转基因材料的次生壁存在增厚现象,而敲除突变体次生壁会有一定程度的塌陷。表明PtoMYB170转录因子参与了杨树茎干次生壁的合成调控过程。(6)荧光定量PCR检测显示,超量表达PtoMYB170基因的转基因杨树中木质素、木聚糖和纤维素合成相关的结构基因均发生了上调,而敲除PtoMYB170的转基因杨树中这些基因均在一定程度上下调。证实PtoMYB170转录因子可调控杨树次生壁合成途径上关键酶基因的表达水平。(7)烟草瞬时浸染试验证明,PtoMYB170基因可激活杨树次生壁合成途径上关键酶基因的启动子表达,进而调控木质素、木聚糖、纤维素的生物合成。(8)次生壁成分分析显示,超量表达PtoMYB170的转基因杨树次生壁中木质素、木聚糖、纤维素等组分均上调,而敲除PtoMYB170的株系中发生了显著下调。上述结果证明PtoMYB170转录因子在杨树次生壁合成中起正调控作用。(9)启动子GUS组织染色结果显示,PtoMYB170基因在转基因拟南芥的莲座叶气孔中表达特异性,该特征与拟南芥AtMYB61基因的表达谱相似。抗旱试验证明,超量表达PtoMYB170的转基因拟南芥在黑暗条件下加速了气孔的关闭,进而提高了转基因材料的抗旱性。综上所述,PtoMYB170基因通过激活次生壁合成相关的关键酶基因的表达,上调了杨树次生壁中木质素、木聚糖和纤维素的含量,促进了杨树次生壁的生物合成。另一方面,PtoMYB170基因参与了转基因拟南芥叶片中气孔的开闭,提高了转基因拟南芥的抗旱能力。