严重脓毒症(severe sepsis)和脓毒症休克是危重病病人死亡的首要原因。尽管采取了改善外科疗法、抗生素治疗和免疫调节等手段,脓毒症仍然是导致重症监护病人最常见死因。脓毒症是机体对感染发生免疫和炎症应答的表现。严重脓毒症定义为脓毒症伴有脏器功能衰竭,而脓毒症休克定义为脓毒症给予充分液体复苏后仍伴有顽固性低血压；其中,脓毒症的心肌损害参与了脓毒症休克的发生与发展。晚近文献报道,严重脓毒症的年发病率为每100000人口中132人,死亡率达50％。美国的临床观察发现,脓毒症病人普遍存在心肌收缩力下降；75％的脓毒症患者存在心血管功能衰竭,表现为严重、持续、甚至有时是顽固性低血压。在过去10年中,临床观察及实验研究证实脓毒症休克病人的心血管功能衰竭与脓毒症的心肌损害有关。细菌或内毒素(LPS)启动了一系列炎症反应,导致心肌收缩力降低、左心室扩大、射血分数下降、对容量负荷收缩反应差、收缩峰值压力/收缩末期容积比值下降等。这种脓毒症和其他全身炎症过程所引起的心肌抑制和细胞损伤,极大的增加氧耗,抑制微循环,减少心肌氧输送,最终导致心肌损伤和肌钙蛋白释放入血循环。心肌抑制与损伤的原因目前尚不明确,因此,探讨其发生机制,寻求防治脓毒症心功能障碍的发生和发展的有效手段,对脓毒症的救治有重要的临床意义。　　 目前认为细胞因子的产生和炎症介质的释放可能在脓毒症心肌损伤起一定作用,包括肿瘤坏死因子(TNF)、IL-1、IL-6等:白细胞衍生的超氧化物及其分子及Caspase的激活,均可能参与心肌损伤的发病。实验研究显示,脓毒症时微血管灌注和心肌氧摄取受损具有不均一性,其潜在的细胞机制包括中性粒细胞激活与内皮的粘附、以及其释放活性自由基和氧化产物等对血管内皮和心肌细胞损伤,导致其功能障碍。同时,内皮细胞活化产生的NO、内皮素以及前列腺素等增多,抑制心肌小梁等长收缩；并促进中性粒细胞跨内皮迁移并活化循环中性粒细胞进入心肌间质；而激活的中性粒细胞所致血管内皮和心肌细胞炎症损伤,增加血管渗漏。因此,中性粒细胞的粘附迁移级联过程在脓毒症心肌抑制的发生发展中起着重要作用。MPO是中性粒细胞的特异性酶,能催化产生多种活性氧化物质,导致氧化应激和氧化性组织损伤,其激活程度与中性粒细胞的浸润程度密切相关,其活性的测定可以反映中性粒细胞浸润情况。　　 P-选择素是一种高糖基化的单链跨膜糖蛋白,是细胞粘附分子选择素家族成员,分子量140KD,主要存在于静息血小板的α颗粒及内皮细胞的Weibel-Palade小体中,通过介导细胞起始粘附、启动参与了包括白细胞的粘附迁移级联过程,在炎症、血栓形成中起着重要作用；同时,P-选择素是影响中性粒细胞与内皮细胞间粘附的重要因子之一。静止状态下,血小板或内皮细胞表面不表达P-选择素,在各种刺激因素刺激下,血小板的α颗粒和内皮细胞的Weibel-palade小体膜与细胞膜迅速融合,导致P-选择素于数分钟内转移到细胞表面,通过与中性粒细胞表面的P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)相互作用,促进血小板或内皮细胞与中性粒细胞的粘附,介导中性粒细胞在内皮上滚动、迁移、聚集和活化。在脓毒症中,P-选择素的主要作用包括介导活化的血小板和单核细胞及中性粒细胞的连接,以及内皮细胞与中性粒细胞的快速粘附、启动炎症反应:与L-选择素、E-选择素共同介导白细胞浸润,引起血管内皮细胞功能紊乱和组织损伤。　　 作为多种补体激活途径的共同产物C5a与脓毒症免疫麻痹、多器官功能衰竭及淋巴细胞凋亡密切相关,在脓毒症的病理生理过程中,通过调节炎症介质、参与凝血、促进PMN聚集、抑制PMN先天免疫、诱导淋巴细胞凋亡等方面起重要作用；C5a作为心肌抑制因子之一对心肌具有直接抑制作用。拮抗C5a已被脓毒症动物实验所证实；本课题组前期自主筛选合成了一种新型C5a拮抗多肽(C5a反义肽),相关实验证明了其能拮抗C5a的生物学活性,并可改善小鼠脓毒症模型的炎症反应。国外研究发现应用抗C5a抗体可逆转脓毒症导致的左心室压力及心肌收缩力的减低,但其具体机制目前尚不明确。在相关的研究显示,内皮细胞P-选择素的表达随着C5a浓度的增加而增加,中性粒细胞粘附率也表现类似的趋势；而阻断C5a可使肺组织中性粒细胞浸润程度显著减轻。但P-选择素表达对脓毒症中性粒细胞在心肌组织中的扣押与损伤有待进一步研究；同时,新合成的C5a反义肽能否在体内拮抗C5a引起内皮细胞的P-选择素过表达及中性粒细胞浸润,从而改善心肌损伤也有待验证。　　 目的　　 探讨脓毒症时心肌组织中性粒细胞浸润与心肌损伤的关系；研究心肌组织P-选择素表达情况与中性粒细胞浸润/扣压及心肌损伤的关系；验证静脉注射C5a反义肽对心肌损伤的保护作用及可能的机制,为脓毒症早期心肌损伤提供新的治疗靶点。　　 方法　　 1)采用盲肠结扎穿孔法建立小鼠脓毒症模型,分正常组、假手术组、脓毒症组、反义肽干预组,在不同时间点(2h、4h、8h、12h)用ELISA方法,检测血清肌钙蛋白Ⅰ浓度,采用MPO试剂盒检测心肌组织MPO活性,比较各时间点各组血清肌钙蛋白Ⅰ浓度和心肌组织MPO活性,了解脓毒症心肌损伤与心肌组织中性粒细胞聚集的关系,观察静脉注射C5a反义肽对心肌损伤及心肌组织中性粒细胞聚集的影响；　　 2)采用实时荧光定量PCR和免疫印迹方法检测心肌组织P-选择素基因和蛋白水平的变化情况,了解脓毒症时心肌组织P-选择素表达水平及与时间的关系,研究其与心肌损伤和心肌组织中性粒细胞聚集的关系,比较各组P-选择素表达水平,探讨静脉注射C5a反义肽对P-选择素表达水平的影响。　　 结果　　 1)C5a反义肽对心肌损伤及心肌组织中性粒细胞聚集的影响　　 正常小鼠心肌组织MPO含量为0.611±0.061U/g。假手术组各时间点心肌组织MPO活性与正常组类似(P>0.05)。造模组2h、4h、8h、12h测得的心肌组织MPO含量分别为1.260±0.068 U/g、1.520±0.105 U/g、1.696±0.041 U/g、1.758±0.136 U/g；反义肽干预组各时间点测得的心肌组织MPO含量分别为1.067±0.095 U/g、1.327±0.093 U/g、1.331±0.053 U/g、1.421±0.185 U/g。与假手术组相比,造模组和反义肽干预组各时间点心肌组织MPO含量有显著升高(P<0.05)；和造模组相比,反义肽干预组心肌组织MPO含量有显著下降(P<0.05)。假手术组各时间点cTnI的浓度与正常组类似(P>0.05)。造模组2h、4h、8h、12h测得的cTnI浓度分别为0.017±0.009 ng/ml、0.106±0.008 ng/ml、0.528±0.066 ng/ml、2.959±0.170 ng/ml。反义肽干预组各时间点cTnI浓度为0.017±0.005 ng/ml、0.062±0.006 ng/ml、O.124±0.008 ng/ml、1.469±0.191 ng/ml。与假手术组相比,在造模后2小时造模组、反义肽干预组cTnI浓度均无显著升高(P>0.05)；造模4小时后造模组和反义肽干预组cTnI浓度较假手术组均有显著升高(P<0.05),且随着时间的延长,cTnI浓度呈上升趋势；和造模组相比,反义肽干预组cTnI浓度有显著下降(P<0.05)。　　 2)C5a反义肽治疗脓毒症小鼠心肌损伤与P-选择素的相关性　　 正常组和假手术组各时间点P-选择素mRNA表达量无显著性差异；而造模组和反义肽干预组P-选择素mRNA表达量随着时间的增加而显著增加。在2、4、8、12各时间点,假手术组P-选择素mRNA表达量分别为:0.726±0.307、0.841±0.443、1.558±0.658、1.162±0.172,和正常组比较无显著性差异(P>0.05),造模组各时间点P-选择素mRNA表达量分别为:5.311±0.990、9.799±0.719、104.336±13.511、192.267±16.611,反义肽干预组P-选择素mRNA表达量分别为:2.76±0.199、4.889±0.772、52.877±8.900、87.878±3.475,与正常组和假手术组比均有显著性增高(P>0.05)；与造模组相比,在4、8、12h时间点,反义肽干预组P-选择素mRNA表达量有显著下降(P<0.05)。　　 正常组和假手术组各时间点P-选择素蛋白表达量无显著性差异(P>0.05)；造模组2h、4h、8h、12h四个时间点各组的P-选择素蛋白相对定量分别为0.399±0.019、0.643±0.023、0.681±0.024和0.69±0.021；与正常及假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)；反义肽干预组2h、4h、8h、12h四个时间点P-选择素蛋白相对定量分别为0.29±0.031、0.43±0.010、0.456±0.013和0.480±0.017；显著低于造模组(P<0.05),但与对照组相比,仍显著高于对照组(P<0.05)。　　 3)心肌组织P-选择素mRNA表达与心肌组织MPO活性,显著正相关,(r=0.728,P=0.000)；心肌组织P-选择素蛋白表达与心肌组织MPO活性呈显著正相关,(r=0.961,P=0.000)　　 结论　　 1)脓毒症早期即己出现心肌损伤,且心肌损伤与心肌组织中性粒细胞的浸润相关；提示中性粒细胞浸润可能参与脓毒症心肌损伤的发病；　　 2)脓毒症时心肌组织P-选择素基因和蛋白表达水平均显著升高,其与心肌组织中性粒细胞的浸润相关,提示,脓毒症时P-选择素表达增加通过介导中性粒细胞扣押而参与心肌损伤的发病；　　 3)C5a反义肽可以减少脓毒症小鼠心肌组织中性粒细胞的浸润,保护心肌,其机制可能是通过降低P-选择素的表达、抑制中性粒细胞的浸润从而改善心肌损伤。