论文部分内容阅读
前言 人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)编码基因位于人类第6号染色体短臂(6p21)上。1958年，由Dausset确立了第一个人类白细胞抗原Mac，它标志着HLA研究的开始。HLA系统之所以引起法医学的重视在于它的高度多态性。HLA每个基因座上均有众多的复等位基因，而且共显性遗传，各个基因座的基因随机组合，形成HLA血型系统高度的遗传多态性。由于HLA多态性是由单个碱基差异造成的序列多态性(即单核苷酸多态性)，各个位点碱基组合又是随机的，故人群中HLA基因型可达10~8种之多，这为法医学个人识别和亲子鉴定提供了理想的遗传标记。所谓单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是指基因组内特定核苷酸位置上存在着两种不同的碱基，其中最少的一种在群体中的频率不少于1％。而HLA上SNPs则要高的多。据估测，人类整个基因组内核苷酸的多态性分布频率为0.08％-0.2％，而位于HLA-Ⅰ类基因的核苷酸多态性分布频率竟高达8.6％。所以HLA基因单核苷酸多态性的研究成为目前法医学研究新的热点。 多个SNPs位点的同时检测，即SNPs位点的复合扩增，是PCR技术上的一大进步，一次复合扩增同时获得多个SNPs位点的信息，提高了个人识别能力，对微量检材鉴定特别有价值，尤其适用于法医学检案。IMS-JST011107、IMS-JST011109、IMS-JST011110是位于JSNP数据库内的HLA-DRA基因座上的3个SNPs位点。HLA-DRA基因是HLA-Ⅱ类抗原重链基因之一，有3个等位基因，由4个外显子组成。这三个SNPs位点位于第三和第四外显子之间。2000年日本学者利用基因组扫描结合序列测定的方法，首次获得了HLA-DRA基因座3个SNPs位点的等位基因频率分布数据。国内尚无有关这三个SNPs位点的群体遗传学数据。本研究利用PCR-SSP技术复合扩增HLA-DRA基因座的3个SNPs位点，调查了它们在中国北方汉族群体中等位基因分布频率，为它们在法医学个人识别和亲子鉴定中的实际应用提供了必需的基础数据，并探讨在法医学领域应用的价值。材料与方法 本研究应用PCR一SSP技术复合扩增HLA一DRA基因座上3个SNPs位点IMS一JSIDlllO7、IMS一JS功11109和IMS一JS，ID 11110，以聚丙烯酞胺凝胶电泳分离扩增产物结合银染显带的方法，对170例无血缘关系的中国北方汉族个体进行多态性分析。摸索IMS一JS功1一107、IMs一Js功一1 209和IMs-Js功11110位点的复合扩增的最适条件，并在亲子鉴定案例中应用。结果 在退火温度为58‘’C，两个PCR复合扩增体系在xMS一JS功2 1 1 07、xMS-JS功川09和IMS一JS功1 1 1 10位点引物浓度比分别为0.4/0.6/1 .0(林mol/L)和0.8/0.8/0.8(林m0FL)时，复合扩增产物的电泳谱型清晰，达到了基因分型的目的。 IMS一JS功1 1 107位点在170例中国北方汉族个体共检出由两个等位基因构成的三种基因型:C/T、C/C、T/T.其中T/T为巧例，频率为0 .0882;C/T为73例，频率为0.4249;C/C为82例，频率为0.4823;等位基因C频率为O‘6971，等位基因T频率为0.3029。IMS一JS功1 1 109位点检出由两个等位基因构成的三种基因型:C/T、C/C、T/T.其中T/T为12例，频率为0.0706;C/T为84例，频率为0.4941;C/C为74例，频率为0.4353;等位基因C频率为0.6823，等位基因T频率为0.3176。IMS一JS功11110位点检出由两个等位基因的构成三种基因型:C/A、A/A、C/C。其中灯A为n例，频率为0.0647;C/A为83例，频率为0.4882。C/C为76例，频率为0.4470:等位基因C频率为0.6912，等位基因A频率为0.3088(表3)。此外，由于本研究采用单侧的引物，3个SNPs位点均未检测到新的变异。 复合扩增3个SNPs位点检测5例亲子鉴定案例，有4例双亲均可以提供给子相应的等位基因，1例父亲不能提供给子相应的等位基因。案例1在IMS一JS，ID 1 1 107位点父、子、母的基因型分别为C/C、T/T、T/T。父不能提供给子等位基因T。其中案例1、2的复合扩增图谱如(图8)所示，案例1-5的基因型检测结果见(表4)。讨论 本研究成功地摸索了IMS一JS，ID 1 1 107、IMS一JS，ID 1 1 109和IMS一JS功1 1 1 10三个位点复合扩增的条件，且效果良好，提高了个人识别能力，具有快速、鉴别率高、节省检材等优点，可以用于个人识别和亲子鉴定案例。 HLA一DRA基因座3个SNPs位点在中国北方汉族群体中的DP值分别为0.5674、0.5664、0.5577;EPP值分别为0.1666、0.1704、0.1679;PIC值分别为0.4223、0.4335、0.4269;H值分别为0.4294、0.4941、0.4882。CDP为0.9165，eEPP为0.4247，累积Pxe为0.8124(表5)。这三个位点都是具有高鉴别能力的遗传标记系统，在法医学个人识别和亲子鉴定中具有很高的应用价值。 本研究获得的中国北方汉族群体IMS一JsTDI 1 107、IMS一JS功1 1109和IMS一JS功11110三个SNPS位点的基因频率分布结果与国外报道的日本人群的频率分布进行x，检验，发现两群体之间无显著性差异(P>0.05)(表6)。这说明了IMS一JS功1 1 107、IMS一JS功11109和IMS一JS功11110位点的等位基因在中国汉族和日本人群中分布具有同源性，这一现象可以用来解释中日两群体具有共?