铅暴露对斑马鱼胚胎miR-9、miR-219及Dicer时序性表达的影响

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目的:  1.为了解斑马鱼胚胎发育过程miRNAs基因(miR-9、miR-219)时序性表达规律。  2.为了解斑马鱼胚胎发育过程Dicer酶基因(Dicer)时序性表达规律。  3.为了解铅暴露对斑马鱼胚胎miR-9、miR-219及Dicer时序性表达的影响。  方法:  实验一,斑马鱼胚胎发育过程miR-9、miR-219及Dicer时序性表达。野生型AB品系斑马鱼胚胎按常规孵养,用Trizol法分别提取正常发育至4、8、12、16、20、24、36、48和72受精后小时(hpf)斑马鱼胚胎的总RNA,茎环法逆转录为cDNA,用荧光定量PCR方法检测胚胎miR-9、miR-219及Dicer表达量。  实验二,铅暴露对斑马鱼胚胎miR-9、miR-219及Dicer时序性表达的影响。斑马鱼胚胎自1hpf起分别用醋酸铅质量浓度为2.5和12.5μmol/L含铅胚胎培养液孵养,观察记录胚胎发育形态及毒性反应,以正常孵养的胚胎为对照。用Trizol法分别提取各组发育至4、10、16、20、24、36、48和72hpf斑马鱼胚胎的总RNA,茎环法逆转录为cDNA,用荧光定量PCR方法检测胚胎miR-9、miR-219及Dicer表达量。  结果:  实验一:在正常胚胎发育过程中,miR-9、miR-219及Dicer各时段表达量之间总的差异有统计学意义(P<0.05)。与胚胎发育全程的基因平均表达水平相比,miR-9在8hpf之前表达量较低(P<0.05),36hpf后表达量持续增高,48hpf和72hpf时表达量显著高于平均水平(P<0.01)。miR-219在8hpf之前表达量也处于较低水平(P<0.05),20hpf后迅速增高,24hpf时达到峰值,并持续到48hpf(P<0.01)。Dicer在胚胎早期(4hpf)就有明显表达(P<0.05),随后表达水平迅速下降,16hpf时达到低点(P<0.05),然后逐渐回升,直至胚胎末期。  实验二:铅暴露斑马鱼胚胎miR-9、miR-219及Dicer时序性表达与对照组比较总的差异有统计学意义(P<0.05),而且暴露浓度与基因表达水平之间存有一定的量效关系。与对照组同时段基因表达水平比较,2.5μmol/L铅暴露组在10和24hpf、12.5μmol/L铅暴露组在16和24hpf时段miR-9表达量有显著性差异(P<0.05)。铅暴露组miR-219在10、16和20hpf时段表达量有显著性降低(P<0.05)。铅暴露组Dicer表达量在4、10、16、20、48及72hpf等大多数时段均显著性低于对照(P<0.05)。  结论:  1.斑马鱼胚胎发育过程miR-9、miR-219时序性表达有其一定规律,miR-9主要在胚胎后期表达;miR-219主要在胚胎中期表达。  2.斑马鱼胚胎发育过程Dicer时序性表达有其一定规律,主要在胚胎早期表达,其次在胚胎后期。  3.铅暴露能够干扰胚胎发育过程miR-9、miR-219及Dicer时序性表达。  4.Dicer可能是铅对胚胎发育毒性的一个重要靶点。
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