论文部分内容阅读
第一部分SLE患者外周血CD4+T细胞miRNA的表达谱及靶基因预测目的：检测SLE患者外周血CD4+T细胞中miRNA的表达情况,并对差异表达的miRNA进行靶基因预测和功能分析。方法：高通量qPCR方法分别检测9例SLE患者和9例正常对照外周血CD4+T细胞中miRNA的表达水平,TargetScan/miRanda/PicTar等靶基因预测软件和go-pathway分析对差异miRNA进行靶基因预测和功能分析。结果：与正常对照组相比,SLE患者CD4’T细胞中存在29种表达异常的miRNA,其中表达上调有miR-1302,-320a,-126,-3200,-107,-29b,-1260,-1913,-451,-98,-3125,-132,-744,-21,-606,-3190-5p16种,表达下调有miR-3926,-4311,-7-2*,-1253,-633,-1279,-3201,-558,-620,-664,-609,-3148,-488*13种。29种miRNA的预测靶基因中,221个基因可能与SLE发病相关。其中调控DNMT1表达的转录因子spl可能是miR-29b的潜在靶基因,MeCP2可能是miR-132的潜在靶基因。结论：SLE患者CD4+T细胞中存在多个miRNA表达异常,可能在SLE发病中起着重要作用。spl可能是miR-29b的潜在靶基因,MeCP2可能是miR-132的潜在靶基因。第二部分miR-29b靶向调控sp1影响DNMT1和DNA甲基化水平参与SLE发病第一节miR-29b在SLE患者外周血CD4+T细胞中的表达目的：扩大样本量进一步验证miR-29b在SLE患者CD4+T细胞中的表达情况。方法：实时定量PCR分别检测36例SLE患者和28例正常对照CD4+T细胞中miR-29b的表达水平,并分析其与sp1和DNMT1蛋白表达水平的相关性。结果：miR-29b在SLE患者CD4+T细胞中表达上调,其表达水平与spl和DNMT1蛋白水平均呈显著负相关(r=-0.551,P=0.018和r=-0.629,P=0.005)。结论：miR-29b异常表达可能通过影响spl和DNMT1水平参与SLE发病。第二节miR-29b通过靶向抑制sp1影响DNMT1表达的验证目的：验证spl调控DNMT1表达；miR-29b通过靶向抑制spl间接调控DNMT1的表达。方法：体外设计合成sp1-siRNA/阴性对照和miR-29b mimics/阴性对照,nucleofector核酸转染仪将spl-siRNA和阴性对照分别瞬时转染Jurkat细胞或人原代外周血CD4+T细胞,48h后收集细胞,采用RT-PCR和western-blot检测sp1和DNMT1的mRNA和蛋白表达情况；同样,通过nucleofector核酸转染仪将miR-29b mimics和阴性对照分别瞬时转染Jurkat细胞或人原代外周血CD4+T细胞,48h后收集细胞,采用RT-PCR和western-blot检测spl和DNMT1的mRNA和蛋白表达情况。结果：在Jurkat细胞中：与对照组比较,spl-siRNA转染组sp1和DNMT1mRNA(P<0.005和P<0.01)和蛋白的表达水平均明显降低；miR-29b mimics转染组sp1和DNMT1mRNA (P<0.005和P<0.01)和蛋白的表达水平较对照组也均显著降低。在人原代CD4+T细胞中,与对照组比较,spl-siRNA转染组sp1和DNMT1mRNA(P均<0.05)和蛋白的表达水平均明显下降；miR-29b mimics转染组sp1和DNMT1mRNA(P均<0.05)和蛋白的表达水平较对照组也均显著下降。结论：sp1能够调控DNMT1表达,miR-29b可能通过与靶基因sp1mRNA结合引起其降解从而降低spl蛋白水平间接影响DNMT1表达。第三节过表达miR-29b诱导正常人CD4+T细胞自身过度活化目的：观察诱导miR-29b过表达对正常人CD4+T细胞DNA甲基化水平,自身免疫相关甲基化敏感基因表达的影响。方法：体外设计合成miR-29b mimics和阴性对照,采用nucleofector核酸转染技术将其转染正常人外周血CD4+T细胞,基因组甲基化水平检测试剂盒检测基因组DNA甲基化水平,HRM-PCR检测CDlla、CD70基因启动子区甲基化水平,RT-PCR和流式细胞术分别检测CD11a和CD70基因mRNA和蛋白水平。结果：与阴性对照组比较,miR-29b mimics转染组基因组DNA甲基化水平显著降低(P<0.05),CDlla、CD70启动子区的甲基化水平也均明显降低(P均<0.05),CD11a和CD70基因mRNA水平(P均<0.05)和蛋白水平(P<0.005和P<0.05)均显著升高。结论：miR-29b过表达可能通过抑制正常人CD4+T细胞DNMT1表达诱导DNA低甲基化,从而促使CD11a、CD70过度表达导致T细胞过度活化。第四节干扰miR-29b表达抑制SLE CD4+T细胞自身过度活化目的：观察抑制miR-29b表达对SLE患者CD4+T细胞DNA甲基化水平、自身免疫相关甲基化敏感基因表达的影响。方法：体外设计合成miR-29b inhibitor和阴性对照,采用nucleofector核酸转染技术将其转染SLE患者外周血CD4+T细胞,RT-PCR和western-blot检测spl和DNMT1基因mRNA和蛋白水平,基因组甲基化水平检测试剂盒检测基因组DNA甲基化水平,HRM-PCR检测CDlla、CD70基因启动子区甲基化水平,RT-PCR和流式细胞术分别检测CDl1a和CD70基因mRNA和蛋白水平。结果：与阴性对照组比较,miR-29b inhibitor转染组CD4+T细胞中sp1和DMMT1mRNA(P均<0.05)和蛋白的表达水平均有显著升高,基因组DNA甲基化水平和CDlla、CD70启动子区的甲基化水平也均显著升高(P均<0.05),CD1la和CD70基因mRNA水平(P均<0.05)和蛋白水平(P均<0.05)均明显降低。结论：干扰miR-29b表达能够通过上调spl和DNMT1水平,在一定程度上逆转SLE患者CD4+T细胞甲基化水平,从而降低CD11a、CD70的表达抑制T细胞过度活化,缓解自身免疫反应。第三部分microRNA-132靶向调控MeCP2影响甲基化敏感基因表达参与SLE发病第一节miR-132在SLE患者外周血CD4+T细胞中的表达目的：扩大样本量进一步验证miR-132在SLE患者CD4+T细胞中的表达情况。方法：实时定量PCR分别检测36例SLE患者和28例正常对照CD4+T细胞中miR-132的表达水平,并分析其与MeCP2蛋白表达水平的相关性。结果：miR-132在SLE患者CD4+T细胞中表达上调,其表达水平与MeCP2蛋白水平呈显著负相关((r=-0.872,P<0.001)。结论：miR-132异常表达可能通过影响MeCP2水平参与SLE发病。第二节miR-132靶向作用MeCP2的验证目的：验证MeCP2是miR-132的靶基因。方法：体外设计合成miR-132mimics和阴性对照,通过nucleofector核酸转染仪将miR-132mimics和阴性对照分别瞬时转染Jurkat细胞或人原代外周血CD4+T细胞,48h后收集细胞,采用RT-PCR和western-blot检测MeCP2mRNA和蛋白表达情况。PCR扩增获得MeCP23’-UTR片段,克隆到psicheck-2表达载体,构建MeCP2野生型荧光素酶重组载体,同时采用定点突变试剂盒构建MeCP2突变型荧光素酶重组载体,分别与miR-132mimics和阴性对照用脂质体法瞬时共转染至Jurkat细胞,48h后收集细胞,运用双荧光素酶报告基因检测系统,以海肾荧光素酶作为内参照,检测萤火虫荧光素酶的活性。结果：在Jurkat细胞和人原代CD4+T细胞中,与对照组比较,miR-132mimics转染组MeCP2mRNA的表达水平均无显著变化(P均>0.05),MeCP2蛋白的表达水平均明显降低；在Jurkat细胞中共转染miR-132mimics,可以抑制MeCP2野生型荧光素酶重组载体荧光素酶的活性(P<0.05),但不能抑制MeCP2突变型荧光素酶重组载体荧光素酶的活性(P>0.05)。结论：MeCP2是miR-132的靶基因,miR-132通过作用于靶基因MeCP23’-UTR区抑制其翻译从而降低MeCP2蛋白的水平。第三节过表达miR-132诱导正常人CD4+T细胞自身过度活化目的：观察诱导miR-132过表达对正常人CD4+T细胞中自身免疫相关甲基化敏感基因表达的影响。方法：体外设计合成miR-132mimics和阴性对照,采用nucleofector核酸转染技术将其转染正常人外周血CD4+T细胞,染色体免疫共沉淀(ChIP)检测MeCP2蛋白与CDlla、CD70启动子区的结合量,HRM-PCR检测CDlla和CD70基因启动子区的甲基化水平,RT-PCR和流式细胞术分别检测CD11a和CD70基因mRNA和蛋白表达水平。结果：与阴性对照组比较,miR-132mimics转染组CD4+T细胞MeCP2蛋白与CDlla和CD70启动子区的结合水平显著降低(P<0.005和P<0.05),但CD11a和CD70基因启动子区甲基化水平均无明显改变(P均>0.05),CDlla和CD70基因mRNA水平(P均<0.05)和蛋白水平(P均<0.05)均显著升高。结论：miR-132可能通过降低MeCP2蛋白水平导致MeCP2与CD11a、CD70启动子区结合量减少,使得其对基因表达的沉默作用下降,促使CD11、CD70过度表达诱导CD4+T细胞过度活化。第四节干扰miR-132表达抑制SLE CD4+T细胞自身过度活化目的：观察抑制miR-132表达对SLE患者CD4+T细胞中自身免疫相关甲基化敏感基因表达的影响。方法：体外设计合成miR-132inhibitor和阴性对照,采用nucleofector核酸转染技术将其转染SLE患者外周血CD4+T细胞,western-blot检测MeCP2蛋白的表达水平,染色体免疫共沉淀(ChIP)检测MeCP2蛋白与CDlla、CD70启动子区的结合量,HRM-PCR检测CD11a和CD70基因启动子区的甲基化水平,RT-PCR和流式细胞术分别检测CDl1a和CD70基因mRNA和蛋白表达水平。结果：与阴性对照组比较,miR-132inhibitor转染组CD4+T细胞中MeCP2蛋白的表达水平显著升高,MeCP2蛋白与CD11a和CD70启动子区的结合水平较阴性对照组明显升高(P均<0.05),但CDlla、CD70启动子区的甲基化水平无显著改变(P均>0.05),CD11a和CD70基因mRNA水平(P均<0.05)和蛋白水平(P均<0.05)较阴性对照组均显著降低。结论：干扰miR-132表达能够通过上调MeCP2水平,在一定程度上降低CD11a、 CD70的表达从而抑制T细胞过度活化,缓解自身免疫反应。