过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)是来自于核激素受体家族的配体激活转录因子。愈来愈多的文献表明,PPARs在多种神经退行性疾病中都具有神经保护作用,然而PPARs是否参与抑郁症的发生发展尚无文献报道。经研究证实,抑郁症不仅具有一般的神经影像学特征,而且在脑内前额叶-边缘系统中存在葡萄糖低代谢的显像特征,前额叶-边缘系统的代谢损害可能正是抑郁症临床症状产生的神经生物学基础。由此提示,代谢性疾病中发挥关键作用的PPARs可能在抑郁症病理进展中扮演重要的角色。大量研究结果显示,抑郁症患者或动物模型的海马和皮层内星形胶质细胞的密度明显减少,三磷酸腺苷(adenosine triphosphate; ATP)含量显著降低,而抗抑郁治疗能够逆转这些现象的发生。这些研究表明,与能量代谢相关的星形胶质细胞功能障碍伴随抑郁症的发病进程。然而,内质网是真核细胞内合成代谢的重要场所,细胞内稳态的改变可引起内质网应激(Endoplasmic reticulum stress, ERs),适宜的内质网应激有利于细胞内环境的恢复,而过度的应激则导致代谢障碍。内质网应激介导炎症通路及细胞凋亡通路的改变与细胞的生长、分化、存活及凋亡密切联系,并在代谢性疾病发生发展过程中起重要作用。在社会健康调查中,发现抑郁症患者的脑内有明显的ERs指标高表达。并有报道星形胶质细胞功能障碍伴随着内质网未折叠蛋白的异常聚集,提示星形胶质细胞内质网应激会影响其功能和能量代谢。体外研究证实,皮质酮可以显著降低大鼠海马星形胶质细胞中胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein; GFAP)的表达水平,导致星形胶质细胞的功能障碍。目前,外源性皮质酮慢性刺激成年啮齿类动物可诱发抑郁样行为,这已是被广泛认可的体外抑郁症模型之一。此外,还有研究显示皮质酮可以诱发星形胶质细胞和PC12细胞等细胞的内质网应激。近年来,研究者还发现激活PPARβ/δ能抑制人心肌细胞和小鼠成肌细胞的内质网应激,以及大鼠帕金森(Parkinson’s disease, PD)模型中的内质网应激。因此,本文工作拟以皮质酮刺激星形胶质细胞建立体外抑郁症模型,研究PPARβ/δ激动剂在星形胶质细胞内质网应激中的保护作用及其作用机制。本项研究不仅拓宽PPARs的药理学作用,更为抑郁症的临床用药提供了新思路。目的：研究、阐明激活PPARβ/δ对内质网应激诱导星形胶质细胞损伤的调节作用及其作用机制。拓宽PPARs的药理学作用,为抑郁症的临床用药提供新思路。方法：1.原代培养大鼠星形胶质细胞,应用免疫细胞化学染色结合体视学计数,检测原代星形胶质细胞的纯度；2.皮质酮慢性刺激星形胶质细胞建立体外抑郁症模型；3.应用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)试验观察PPARβ/δ激动剂GW0742对皮质酮诱导星形胶质细胞损伤的影响；4.应用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)和免疫蛋白印迹(western blotting, WB)方法观察皮质酮对星形胶质细胞内三种PPARs亚型受体表达的影响,及用PPARβ/δ激动剂处理后细胞内三种PPARs亚型受体表达的变化；5.应用RT-qPCR方法,观察PPARβ/δ激动剂是否影响皮质酮对星形胶质细胞内miR181a水平的调节；6.应用双荧光素酶报告基因(dual-luciferase reporter gene assay)方法,检测葡萄糖调节蛋白78 (glucose regulated protein 78, Grp78)和miR181a之间的靶向关系；7.应用WB方法检Grp78和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)的蛋白表达,观察PPARβ/δ激动剂对皮质酮诱导星形胶质细胞内质网应激的影响；8.应用流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞凋亡率,用WB方法检测凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12 (cysteiny aspartate-specific protease-12, caspase-12)和激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 (cleaved-cysteiny aspartate-specificprotease-3, cleaved-caspase-3)的蛋白表达水平,观察PPARβ/δ激动剂对皮质酮所致星形胶质细胞凋亡的影响；9.应用酶联免疫吸附试剂(enzyme-linked imm-uno sorbent assay, ELISA)方法检测甲基化转移酶的活性及表达水平,并观察PPARβ/δ激动剂对miR181a甲基转移酶活性及表达水平的影响；10.采用亚硫酸氢盐测序法(bisulfite sequencing PCR, BSP),检测PPARβ/δ激动剂对miR181a1 CpG启动子区甲基化的影响。结果：1. PPARβ/δ是原代星形胶质细胞内表达量最丰富的受体亚型PPARα、PPARβ/δ和PPARγ的mRNA和蛋白表达水平在星形胶质细胞内一致,且其表达水平符合正常情况。对照组星形胶质细胞中PPARβ/δ的mRNA和蛋白表达水平分别为72%和78%(P<0.05),而皮质酮慢性刺激星形胶质细胞会显著降低PPARβ/δ的表达水平(P<0.05),其表达水平分别降低45%和74%。2.激活PPARβ/δ减轻皮质酮诱导的星形胶质细胞损伤一定浓度的皮质酮慢性刺激星形胶质细胞会导致活细胞数量减少,降低细胞活力,与正常对照组相比活细胞数减少13%(P<0.05)。激活PPARβ/δ受体可逆转皮质酮所致星形胶质细胞的损伤(P<0.05),与正常对照组相比活细胞数减少5%。当PPARβ/δ被阻断后,再一次激活PPARβ/δ所产生的保护作用会拮抗(P<0.05),与正常对照组相比活细胞数减少11%。3.激活PPARβ/δ抑制皮质酮诱导的星形胶质细胞内质网应激 激活PPARβ/δ减轻皮质酮诱导的星形胶质细胞内质网应激,显著地降低细胞内质网应激相关的蛋白Grp78和CHOP的表达(P<0.05)。4.激活PPARβ/δ抑制内质网应激所致星形胶质细胞的凋亡 皮质酮慢性刺激所致的内质网应激会激活细胞内的凋亡通路,诱导星形胶质细胞内caspase-12及cleaved-caspase-3的表达(P<0.05)。激活PPARβ/δ能显著地抑制皮质酮诱导的caspase-12及cleaved-caspase-3表达上调(P<0.05)。PPARβ/δ被阻断后再次激活PPARβ/δ, caspase-12及cleaved-caspase-3的表达与皮质酮慢性刺激组相比无显著差异。同时,激活PPARβ/δ能显著地抑制皮质酮诱导的细胞凋亡率的增加,其凋亡率减少5%(P<0.05)。5.激活PPARβ/δ上调星形胶质细胞内miR-181 a的表达水平基础状态下,两种基因型细胞内热休克蛋白5(heat shock protein 5, HSPA5)的表达无显著性差异。miR-181 a mimics转染后WT型细胞内HSPA5表达显著低于Mut型细胞(P<0.05),说明miR-181a可以靶向性抑制HSPA5。激活PPARβ/δ显著削弱皮质酮对星形胶质细胞内miR-181a的抑制作用,增加miR-181a的表达(P<0.05)。6.激活PPARβ/δ抑制DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, Dnmts)的活性和表达,并抑制miR-181a1 CpG启动子区的甲基化激活PPARβ/δ可以显著抑制皮质酮诱导的星形胶质细胞中miR-181al甲基转移酶的活性和表达(P<0.05)。同时,激活PPARβ/δ可以显著减缓miR-181a1 CpG启动子区甲基化(P<0.05),从而进一步促进miR-181a表达的增加。结论：1.激活PPARβ/δ通过抑制内质网应激减轻皮质酮所致星形胶质细胞损伤。2.激活PPARβ/δ通过增加miR-181a的表达来抑制内质网应激相关蛋白Grp78的表达,进而阻断内质网应激反应及其所介导的凋亡通路。3.激活PPARβ/δ抑制Dnmts的活性和表达、抑制miR-181a1 CpG启动子区甲基化反应,从而增加miR-181a的表达。本文工作的主要创新之处：1.揭示PPARβ/δ激动剂通过上调星形胶质细胞miR181a的表达,进而靶向性抑制Grp78介导的内质网应激的新作用；2.阐明PPARβ/δ激动剂通过抑制星形胶质细胞中甲基化转移酶的活性和表达,并下调miR-181a CpG启动子区的甲基化,从而增加miR-181a表达的作用机制。