肺癌是当今世界上对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤，也是我国的第一大癌症，是今后一个时期我国癌症防治的重中之重。手术治疗、放射治疗和化学药物治疗是肺癌的三种主要临床治疗方法，而且这些治疗方法常常二种或三种方法联合使用。但是肺癌总的临床治疗效果仍然较差，而且自20世纪50年代以来，肺癌治疗总的疗效没有明显的提高。肿瘤细胞的多药耐药性是影响肿瘤临床治疗效果的重要因素之一，为了克服肿瘤细胞的多药耐药性从而提高肿瘤临床治疗的疗效，必须首先了解肿瘤细胞多药耐药性发生的机制，了解多药耐药肿瘤细胞的生物学特性。在体外建立理想的人肿瘤多药耐药细胞系可以为这两方面的研究提供可靠的实验模型。放射治疗是恶性肿瘤的主要治疗手段之一，而且临床上常常放疗与化疗联合使用。但是，多药耐药的肿瘤细胞对放疗是否也产生辐射耐受性值得深入研究。由于实体肿瘤内普遍存在着乏氧的肿瘤细胞，而且这些乏氧肿瘤细胞对放疗和化疗均具有耐受性，而辐射诱导的旁观者效应为提高放射线对乏氧肿瘤细胞的杀伤作用提供了可能，因而值得进行研究。目的一、顺铂诱导人肺腺癌多药耐药单克隆细胞株SPC-A-1/CDDP-4的建立及其生物学特性研究：模拟临床化疗用药，筛选建立一株顺铂（CDDP）诱导的人肺腺癌多药耐药单克隆细胞株SPC-A-1/CDDP-4，供离体以及在体进行人肺腺癌细胞多药耐药机制和辐射敏感性研究的实验模型使用。二、SPC-A-1/CDDP-4细胞多药耐药机制研究：以亲代的SPC-A-1细胞为对照，对大剂量CDDP间歇作用诱导得到的人肺腺癌多药耐药单克隆细胞株SPC-A-1/CDDP-4细胞多药耐药的机制进行研究，以期阐明其多药耐药机理，从而为克服恶性肿瘤的多药耐药性，提高恶性肿瘤临床治疗的疗效提供实验依据。三、SPC-A-1/CDDP-4细胞辐射敏感性研究：分别在离体细胞水平和整体动物水平研究SPC-A-1/CDDP-4细胞和其亲代SPC-A-1细胞对¹³⁷Csγ射线的辐射敏感性，观察多药耐药的SPC-A-1/CDDP-4细胞是否具有对¹³⁷Csγ射线的交叉耐受性。四、乏氧T98G细胞X-射线诱导旁观者效应研究：观察乏氧的人恶性神经胶质瘤细胞株T98G细胞中X-射线照射是否能够诱导产生旁观者效应，并对其发生机制进行初步研究。方法1．顺铂诱导人肺腺癌多药耐药单克隆细胞株SPC-A-1/CDDP-4的建立及其生物学特性研究1．1人肺腺癌多药耐药单克隆细胞株SPC-A-1/CDDP-4的建立以大剂量CDDP（4μg/ml）间歇作用于人肺腺癌细胞SPC-A-1，诱导得到具有较高多药耐药性的人肺腺癌多克隆细胞，再通过有限稀释法，筛选得到具有较高多药耐药性的人肺腺癌单克隆细胞株SPC-A-1/CDDP-4。1．2 SPC-A-1/CDDP-4细胞多药耐药性的检测应用MTT法检测SPC-A-1/CDDP-4细胞和其亲代SPC-A-1细胞对阿霉素（ADM）、顺铂（CDDP）、甲氨蝶呤（MTX）和长春新硷（VCR）的交叉耐药性。1．3 SPC-A-1/CDDP-4细胞生物学特性研究采用细胞计数法对SPC-A-1/CDDP-4细胞和其亲代SPC-A-1细胞生长曲线进行测定，以细胞培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制细胞生长曲线。按照公式法计算SPC-A-1/CDDP-4细胞和其亲代SPC-A-1细胞的倍增时间。2．SPC-A-1/CDDP-4细胞多药耐药机制研究2．1细胞内GSH含量的检测：应用Tietze还原酶法，对SPC-A-1/CDDP-4细胞和SPC-A-1细胞内GSH的含量进行检测。2．2细胞中LRP、MRP和GST-πmRNA表达情况的检测应用二步法RT-PCR对SPC-A-1/CDDP-4细胞和SPC-A-1细胞中LRP、MRP和GST-πmRNA的表达情况进行检测。2．3细胞中LRP、MRP和GST-π蛋白表达情况的检测应用免疫细胞化学法（ICC）检测SPC-A-1/CDDP-4细胞和SPC-A-1细胞中LRP、MRP和GST-π蛋白质的表达情况。2．4增敏化合物BSO的化学增敏作用用1mg/ml的BSO分别与SPC-A-1/CDDP-4细胞和SPC-A-1细胞作用6小时后，应用MTT法检测SPC-A-1/CDDP-4细胞和SPC-A-1细胞对化学治疗药物ADM、CDDP、MTX和VCR敏感性的变化。3．SPC-A-1/CDDP-4细胞辐射敏感性研究3．1离体研究3．1．1离体辐射敏感性研究应用集落形成法研究SPC-A-1/CDDP-4细胞和亲代的SPC-A-1细胞在有氧和乏氧条件下，二者辐射敏感性的差异。3．1．2细胞内GSH含量的检测应用Tietze还原酶法，对SPC-A-1/CDDP-4细胞和SPC-A-1细胞在有氧和乏氧条件下细胞内GSH的含量进行检测。3．1．3增敏化合物BSO的离体辐射增敏作用应用集落形成法研究SPC-A-1/CDDP-4细胞和亲代的SPC-A-1细胞在有氧和乏氧条件下，BSO对二者辐射敏感性的影响。3．2在体研究3．2．1荷瘤裸小鼠模型的建立将SPC-A-1/CDDP-4细胞和亲代的SPC-A-1细胞分别接种到BCLB/c裸小鼠（SPF级）右后肢皮下，建立荷瘤的裸小鼠模型，供后续实验使用。3．2．2最佳单次照射剂量的筛选选用接种亲代SPC-A-1细胞的裸小鼠作为实验对象，实验分为5组，每组3只裸小鼠，待裸小鼠体内移植肿瘤生长至直径达到0.5cm时，分别给予0 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy和12 Gy的单次¹³⁷Csγ-射线照射，观察并记录肿瘤大小变化及生长情况，绘制肿瘤生长曲线，计算肿瘤抑制率，得到最佳单次照射剂量。3．2．3肿瘤生长曲线绘制用最佳单次照射剂量的¹³⁷Csγ-射线照射荷瘤裸小鼠的肿瘤灶，每3日观察并记录肿瘤大小变化及生长情况，绘制肿瘤生长曲线，计算肿瘤抑制率，体内观察实验细胞对¹³⁷Csγ射线辐射敏感性的差异。3．2．4增敏化合物BSO的在体辐射增敏作用根据文献，得到BSO裸小鼠体内的最佳给药剂量，然后应用腹腔注射的方法，分别在照射前和照射后给实验裸小鼠腹腔注射BSO，观察BSO的在体辐射增敏作用。4．乏氧T98G细胞X-射线诱导旁观者效应研究4．1乏氧T98G细胞的培养将人的恶性神经胶质瘤细胞株T98G细胞置于乏氧工作台内，在0.1％氧浓度，37℃，5％CO₂，饱和湿度的条件下培养细胞。4．2乏氧T98G细胞X-射线诱导旁观者效应研究对在0.1％氧浓度条件下培养的人恶性神经胶质瘤细胞株T98G细胞给予一定剂量的X-射线照射，然后将接受X-射线照射的T98G细胞与未接受X-射线照射的T98G细胞共同培养在同一个培养皿内，或者用条件培养基培养未接受X-射线照射的T98G细胞，以微核计数法观察未受到X-射线照射的共培养T98G细胞以及条件培养基培养的未受到X-射线照射的T98G细胞中微核的产量。4．3乏氧T98G细胞X-射线诱导旁观者效应发生机制的研究4．3．1 DMSO对乏氧T98G细胞微核产量的影响用微核计数法观察自由基清除剂1％DMSO对乏氧T98G细胞微核产量的影响。4．3．2 NO和ROS的原位检测原位检测受到照射的T98G细胞及未受到照射的旁观者T98G细胞中NO和ROS的含量。结果一、人肺腺癌多药耐药单克隆细胞株SPC-A-1/CDDP-4细胞的建立：通过使用4μg/ml的大剂量CDDP间歇作用于人肺腺癌细胞SPC-A-1，成功筛选建立了一株具有中度多药耐药性的人肺腺癌多药耐药单克隆细胞株SPC-A-1/CDDP-4，耐药性检测发现其对阿霉素（ADM）、顺铂（CDDP）、甲氨蝶呤（MTX）和长春新硷（VCR）有不同程度的交叉耐药性。SPC-A-1/CDDP-4细胞经反复传代以及细胞冻存和复苏后观察，细胞生长特性稳定，并经反复进行离体细胞多药耐药性检测，结果表明SPC-A-1/CDDP-4细胞的多药耐药性稳定，可供后续实验使用。二、SPC-A-1/CDDP-4细胞的生物学特性：应用细胞计数法测定和绘制了SPC-A-1/CDDP-4细胞和其亲代SPC-A-1细胞的生长曲线。公式法计算得到SPC-A-1/CDDP-4细胞的倍增时间是51.0 h，其亲代SPC-A-1细胞的倍增时间是39.9 h，SPC-A-1/CDDP-4细胞的倍增时间较其亲代SPC-A-1细胞延长了约11 h，SPC-A-1/CDDP-4细胞和SPC-A-1细胞生长10天，未见到明显的生长抑制。三、SPC-A-1/CDDP-4细胞多药耐药的机制研究：SPC-A-1/CDDP-4细胞的GSH含量高于其亲代SPC-A-1细胞；SPC-A-1/CDDP-4细胞中LRP和GST-π在mRNA水平和蛋白质水平均有表达，而在SPC-A-1细胞中均无表达：1mg/ml的BSO可以增加离体SPC-A-1细胞和SPC-A-1/CDDP-4细胞对化学治疗药物CDDP、ADM、MTX和VCR的敏感性。四、SPC-A-1/CDDP-4细胞的离体辐射敏感性研究：研究发现：SPC-A-1/CDDP-4细胞与其亲代的SPC-A-1细胞相比不仅具有较高的多药耐药性，而且对¹³⁷Csγ射线照射也有一定的交叉耐受性；这可能与SPC-A-1/CDDP-4细胞内GSH的含量不论是在有氧或乏氧条件下均高于其亲代的SPC-A-1细胞有关。五、SPC-A-1/CDDP-4细胞的在体辐射敏感性研究：预实验单剂量8 Gy ¹³⁷Csγ射线照射后，观察21天，记录肿瘤大小变化及生长情况，绘制肿瘤生长曲线，计算得到肿瘤抑制率，肿瘤抑制率=（对照组肿瘤平均大小-给药组肿瘤平均大小）/对照组肿瘤平均大小×100％。其中SPC-A-1细胞在裸小鼠体内模型中的肿瘤抑制率为50.63％，SPC-A-1/CDDP-4细胞在裸小鼠体内模型中的肿瘤抑制率为37.56％，表明SPC-A-1/CDDP-4细胞在裸小鼠体内模型中对¹³⁷Csγ射线可能也有一定的耐受性。正式的裸小鼠模型在体实验现在正在进行之中，到五月下旬完整的在体实验结果即可得出。六、乏氧T98G细胞X-射线诱导旁观者效应研究：在0.1％氧浓度条件下培养的T98G细胞接受一定剂量的X-射线照射后，共培养的未接受X-射线照射的T98G细胞以及用条件培养基培养的未接受X-射线照射的T98G细胞中微核产量均有增加；自由基清除剂1％DMSO可以减少上述细胞中微核的产量；在接受照射的T98G细胞及未接受照射的旁观者T98G细胞中均可以检测到NO和ROS的产生。结论一、通过大剂量CDDP间歇作用，成功诱导并筛选建立了具有中度多药耐药性的人肺腺癌多药耐药单克隆细胞株SPC-A-1/CDDP-4，其生长特性与多药耐药性稳定，可以为离体以及在体人肺腺癌多药耐药机制和辐射敏感性研究提供可靠的实验模型。二、大剂量CDDP间歇作用诱导得到的人肺腺癌多药耐药单克隆细胞株SPC-A-1/CDDP-4细胞的多药耐药性可能与其细胞内较高的GSH含量以及高表达肺耐药蛋白LRP和GST-π有关。增敏化合物BSO对离体的SPC-A-1细胞和SPC-A-1/CDDP-4细胞均有一定程度的化学增敏作用。三、体外研究表明：SPC-A-1/CDDP-4细胞与其亲代的SPC-A-1细胞相比，不仅具有较高的多药耐药性，而且对¹³⁷Csγ射线照射也有一定的交叉耐受性；这可能与SPC-A-1/CDDP-4细胞内GSH的含量不论是在有氧或者乏氧条件下均高于其亲代的SPC-A-1细胞有关。增敏化合物BSO对离体的SPC-A-1细胞和SPC-A-1/CDDP-4细胞均有一定程度的辐射增敏作用。裸小鼠模型的体内预初实验结果也表明，SPC-A-1/CDDP-4细胞在裸小鼠体内模型中比其亲代SPC-A-1细胞对¹³⁷Csγ射线照射具有较强的辐射耐受性。四、在乏氧的T98G细胞中也可以观察到X-射线照射所诱导的旁观者效应；自由基、NO和ROS可能参与了乏氧T98G细胞中X-射线诱导旁观者效应的发生，这可以为进一步研究肿瘤乏氧细胞的抗辐射机理提供依据。