蛇毒是由蛇的毒液腺分泌出的一种天然毒蛋白,化学成分非常复杂,含有多种蛋白质、多肽、酶类和其他非蛋白类小分子物质,具有广泛的生物学活性。心脏毒素和磷脂酶A₂是蛇毒液中含量较为丰富的组分,由于其具有多种药理学活性和较高的临床应用价值,近年来得到了广泛的关注和深入的研究。而获得单一的活性成分是对其进行理化性质分析、药理活性检测和临床应用的前提。传统的眼镜蛇蛇毒分离纯化方法过程繁复,耗时较长,而且一般仅应用于实验室,工艺较难放大用于规模化生产。因此,本课题拟在实验室前期工作的基础上,参考浙江大学童富淡等人的分离纯化方法,采用有机溶剂对眼镜蛇粗毒进行预处理,并结合层析方法欲建立一种简便、得率高、产物纯度高且适用于规模化分离纯化眼镜蛇毒心脏毒素等小分子功能多肽的工艺路线。并对纯化出的功能多肽进行初步的理化性质和药理学性质鉴定,为研制开发新的蛇毒多肽类药物提供一定的实验基础和理论依据。方法与结果1.本文建立了简单有效可同时从广东舟山眼镜蛇蛇毒中分离纯化出磷脂酶A₂和心脏毒素两种组分的方法。即采用有机沉淀预处理结合凝胶过滤和离子交换层析完成。该方法纯化得到的产物纯度和得率都比较高,且适用于多种产地的舟山眼睛蛇毒的分离纯化。2.对磷脂酶A₂组分GI2的理化性质及药理学性质进行了鉴定。该组分的分子量约为14300Da,纯度和得率分别为99%和9.5%。PLA₂酶活力可达133μmol·mg^-1·min^-1,其最适反应温度和pH分别为60℃和8.5,具有较高的热稳定性,金属离子对酶活性有较大影响,Ca²⁺、Mg²⁺可增强PLA₂的酶活性,K⁺、Ni²⁺对酶活性稍有抑制,Fe²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Co²⁺和Cr²⁺对酶活性有较强的抑制作用。蛙心灌流实验及MTT实验结果表明,该组分还具有较强的心脏毒性,并能够以剂量依赖性方式抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖。3.对心脏毒素组分GI3的理化性质及药理学性质进行了鉴定。该组分的分子量为6725.8Da,纯度和得率分别为99%和10.1%。Edman降解法测定了N末端30个氨基酸序列,LKCNKLVPLFYKTCPAGKNLCYKMFMVSNL,通过同源性检索,发现它与心脏毒素保守序列具有较高的同源性,证明它是一种心脏毒素。这种毒素的半数致死剂量为2.4795mg/kg,通过热板实验测得其具有长效的镇痛活性,并且呈剂量相关性。另外对乳腺癌细胞MCF-7具有剂量相关的细胞毒性。结论1.建立了从舟山眼睛蛇蛇毒中同时分离纯化磷脂酶A₂和心脏毒素两种成分的有效方法。2.经性质鉴定,发现离子交换主峰GI2是一种磷脂酶A₂组分,其纯度和得率分别为99%和9.5%,相对分子质量为14300Da。该酶热稳定性较高,最适反应温度和pH分别为60℃和8.5,金属离子对其酶活性有一定的影响。另外它还具有心脏毒性和细胞毒性。3.经性质鉴定,发现离子交换主峰GI3是一种心脏毒素组分,其纯度和得率分别为99%和10.1%,相对分子质量为6725.8Da。N末端序列测定和同源性检索证实GI3是心脏毒素。其具有较强的镇痛活性和细胞毒性。