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研究背景:肿瘤对人体的危害极大,其引起的死亡大多是因为肿瘤转移。虽然我们在乳腺癌的诊断和治疗方面取得了各种临床成果,但晚期乳腺癌的总体生存率仍然很低。有研究表明,乳腺癌细胞异质性高、转移性强是改善预后的主要挑战。因此,更好地了解乳腺癌细胞转移的发生和发展的分子机制是刻不容缓的。泛素化和去泛素化之间的平衡对于维持细胞中的基本生物过程至关重要。去泛素酶（DUBs）可以将泛素（UBQ）从泛素化的底物中解聚出来,从而起到调节其活性和稳定性的功能。关于去泛素酶如何调控去泛素化过程及其相关功能的研究已经非常广泛。此外,越来越多的研究揭示了去泛素酶在癌症发展中的作用。目前关于去泛素酶的研究结果,涉及人类癌症的不同方面,包括增殖、细胞凋亡、细胞周期控制、DNA损伤反应（DDR）、肿瘤抑制、肿瘤发生和转移,使它们成为癌症治疗的有希望的治疗靶点。USP36是USP家族中的一员,是一种对调节核极结构和功能至关重要的去泛素酶。蜗牛（Snail1）蛋白是一种突出的上皮-间质转化（EMT）转录因子,并促进转移。临床上,Snail1蛋白的表达与化疗耐药、生存率下降、高复发率和不良预后有关。Snail1蛋白是不稳定的,它可以藉由泛素化介导的蛋白酶体途径实现高效降解。然而,去泛素酶可以通过调节泛素化介导的水解过程来防止Snail1蛋白的降解。一些去泛素化酶已被确定为稳定Snail1蛋白的特异性去泛素酶,并在Snail1蛋白介导的肿瘤转移中发挥重要作用。本研究提出一种USP36调控肿瘤转移相关生物学特征的假设。并探讨其对乳腺癌细胞转移相关病理特征的影响及其发生发展的分子机制,即USP36通过影响Snail1泛素化水平进而影响Snail1蛋白的表达。目的:（1）初步检测乳腺癌细胞内USP36的m RNA和蛋白质表达水平。（2）探讨敲除USP36表达后对乳腺癌细胞系的侵袭性表型的影响。（3）验证USP36是否通过影响Snail1泛素化水平进而影响Snail1蛋白的表达。（4）通过挽救实验验证Snail1是否参与了USP36调节的细胞表型。方法:（1）藉由实时荧光定量PCR的途径,检验乳腺癌细胞系内USP36的表达水平,采用western blot检测USP36蛋白质表达水平。（2）选取在乳腺癌中USP36表达较高的细胞系,设计两条小干扰RNA并转染至乳腺癌细胞系以敲除内源性USP36水平。（3）采用划痕实验、侵袭小室实验,分别检测敲除USP36后乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。采用western blot检测敲除内源性USP36后对上皮-间充质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）标记蛋白（E-cadherin和vimentin）和金属基质蛋白酶（MMP-2和MMP-9）的影响。（4）通过生物信息学方法预测可能与USP36存在相互作用的蛋白质,并通过免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）技术验证两个蛋白之间是否存在相互作用。通过Immunoprecipitation技术检测Snail1的泛素化水平。（5）通过western blot技术检测敲除USP36后细胞内Snail1蛋白的表达,通过定量PCR技术检测敲除USP36后细胞内Snail1 m RNA水平。（6）构建Snail1表达质粒,并与USP36特异性小干扰RNA共转染至乳腺癌细胞,采用western blot技术检测验证转染后Snail1的蛋白表达。通过划痕和侵袭小室实验检测Snail1表达恢复对细胞迁移和侵袭能力的影响。采用Western blot技术检测恢复Snail1表达对上皮-间充质转化标记蛋白以及金属基质蛋白酶的影响。结果:（1）定量PCR结果显示:乳腺癌细胞系中的USP36 m RNA水平显著高于正常对照细胞（MCF-10A）。与此同时,western blot的检测结果显示,USP36蛋白在以下四个乳腺癌细胞系（MCF-7,BT-474,MDA-MB-231,MDA-MB-468）中的表达水平显著高于正常的乳腺上皮细胞（MCF-10A）中的表达水平。（2）选取USP36表达较高的MCF-7和MDA-MB-231细胞系中采用小RNA干扰敲除USP36后,定量PCR的检测结果显示USP36的m RNA表达水平显著降低。（3）由侵袭小室实验以及划痕实验的结果可知,USP36敲除后,MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力均显著降低。除此之外,敲除USP36后,E-cadherin的表达水平升高,vimentin、MMP-2和MMP-9的蛋白水平降低。（4）通过软件预测我们发现USP36可能与Snail1存在相互作用。IP实验的检测结果显示USP36蛋白和Snail1存在互相作用。敲除USP36后Snail1的泛素化水平相比对照组明显上升。（5）通过western blot和定量PCR的检测我们发现,敲除USP36后Snail1的蛋白表达水平降低,而m RNA水平无明显改变。（6）构建Snail1表达质粒和USP36小干扰RNA共转染后可以显著恢复细胞内Snail1的表达水平。挽救实验的结果表明,恢复细胞内Snail1的表达水平可以显著逆转USP36沉默引起的细胞迁移和侵袭能力下降。除此之外,恢复Snail1后,E-cadherin表达下降,而vimentin、MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平显著升高。结论:（1）USP36在乳腺癌细胞系呈现出高表达的趋势,而沉默USP36则可以抑制其侵袭以及迁移,并抑制上皮-间充质转化过程。（2）USP36可以通过与Snail1互相作用调节Snail1泛素化水平,进而调节其蛋白表达水平。（3）过表达Snail1可以取消USP36沉默对细胞迁移和侵袭的抑制作用,并促进上皮间充质转化进程。