目的:近江牡蛎是我国南部沿海常见的养殖贝类。其壳为中药材"牡蛎"的来源之一;其肉品质鲜美、富含多种营养成分,且具有多种生物活性;尤其是近江牡蛎多糖具有抗氧化、生精、免疫调节等活性。因此如何合理、科学地开发近江牡蛎资源是一个有意义的课题。当前关于近江牡蛎多糖的研究报道虽然不少,但不够深入。因此本文拟以中医理论为依据,应用现代技术手段,以近江牡蛎肉为原材料,系统研究近江牡蛎多糖分离、纯化工艺及其理化性质,并对其进行硒化修饰,得到硒化近江牡蛎多糖。研究近江牡蛎多糖体外抗氧化活性及其作用机制,进而研究其对环磷酰胺致氧化应激小鼠生精能力的影响,探讨近江牡蛎多糖改善环磷酰胺致氧化应激小鼠生精活力的作用机制。为近江牡蛎多糖相关药物研究积累资料。为其开发成药品及相关功能保健食品奠定理论基础。方法:1.近江牡蛎多糖提取、分离及纯化采用超声辅助提取近江牡蛎肉中多糖,将近江牡蛎粗多糖用磁性壳聚糖微球(MCM)吸附去除蛋白质,再用DEAE-纤维素52及Sephadex G100柱分离纯化粗多糖,得到纯化多糖组分。2.近江牡蛎多糖理化性质及结构鉴定采用苯酚硫酸法测定总糖含量,考马斯亮蓝法测定蛋白质含量,BaCl2-明胶法测定硫酸基含量,乌氏粘度计法测定多糖相对粘度,乙酰化反应-GC法测定近江牡蛎多糖的单糖组成,HPLC测定纯度及分子量,UV法测定吸收情况,FT-IR法测定官能团及糖环形式,甲基化、GC-MS测定糖苷键连接位点、糖基链接次序及分支情况,NMR法测定异头碳构型、羟基取代情况及糖基链接次序,采用刚果红法测定糖链是否具有三股螺旋结构。3.近江牡蛎多糖硒化修饰通过BaCl2-HN03催化,采用Na2Se03硒化修饰近江牡蛎多糖,得到其硒化衍生物。4.ORP抑制H202诱导TM4细胞氧化应激作用机制研究以小鼠睾丸Sertoli细胞(TM4细胞)为实验对象,采用H202建立TM4细胞氧化应激模型,考察近江牡蛎多糖及其硒化衍生物的抗氧化能力,同时采用实时荧光定量PCR及Western Blot技术检测TM4细胞中Nrf2基因表达水平和与其相关的上游调控因子及下游目标蛋白的影响,来研究近江牡蛎多糖及其硒化衍生物的抗氧化活性作用机制。5.ORP抑制环磷酰胺所致小鼠生殖损伤及其作用机制将Balb/c小鼠腹腔注射环磷酰胺,建立环磷酰胺介导的雄性小鼠氧化应激模型,考察ORPp及ORPse对氧化应激小鼠的睾丸组织恢复能力、精子存活率、畸形精子率,采用实时荧光定量PCR及Western Blot技术检测小鼠睾丸中Nrf2基因表达水平和与其相关的上游调控因子及下游目标蛋白的影响来研究ORPp及ORPse拮抗环磷酰胺导致生殖损伤的作用机制。成果:1.近江牡蛎多糖提取、分离及纯化(1)通过超声辅助提取近江牡蛎脏器中多糖,其得率为9.74±0.55%。近江牡蛎粗多糖中蛋白质含量8.62±0.23%。(2)将粗多糖进一步用MCM吸附除蛋白,所合成的MCM材料粒径为2-6μm,最佳除蛋白吸附温度50℃,吸附反应时间4h。该方法为物理吸附,吸附过程动力学和吸附等温线分别可以用拉格朗日准一级动力学方程及Freundlich方程拟合。此外,根据吸附方程求得△G及△Ea判断,MCM吸附是自发、吸热的物理吸附反应。(3)近江牡蛎粗多糖经DEAE-纤维素52柱按极性洗脱后再经Sephadex G100筛分后,得到一个纯化组分ORPp,ORPp得率为32.7%。2.近江牡蛎多糖理化性质及结构鉴定ORPP中总糖含量为88.7%,硫酸基含量为1.2%,蛋白质含量0.17%,糖醛酸含量为8.59%,相对粘度为1.15。其相对分子质量为656 kDa。ORPP由葡萄糖构成。ORPP具有 D-Glc-(1→、→3)-D-Glc-(1 →、→4)-D-Glc-(1→及→3,4)-D-Glc-(1→结构,其分支率约为12.7。ORPp无三股螺旋结构。3.近江牡蛎多糖硒化修饰通过BaCl2-HN03催化,采用Na2Se03硒化修饰近江牡蛎多糖,得到其硒化衍生物ORPse中Se元素含量为181.9±5.6μg/g。4.近江牡蛎多糖对TM4细胞中Nrf2/ARE通路的影响ORPp及ORPse均可以提高H202诱导的氧化应激TM4细胞存活率,且细胞存活率与给药剂量相关。表明ORPp及ORPse均可以提高TM4细胞抗氧化能力。通过实时荧光定量PCR技术及Western Blot技术分析,ORPP及ORPse可能通过激活Nrf2/ARE通路,增加Nrf2与Keap1解偶联使其进入胞核,激活ARE元件,促进SOD、HO-1、NQO1等抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶生成,从而提高TM4细胞抗氧化能力。5.近江牡蛎多糖对环磷酰胺介导的雄性小鼠生殖损伤的作用ORPp及ORPse可能作为诱导物,提高小鼠睾丸组织中Nrf2表达水平,激活Nrf2/ARE信号通路,有助于下游Ⅱ相解毒酶NQO1及抗氧化酶HO-1等目标基因表达,提高机体对外界抵抗能力,避免因环磷酰胺导致的氧化应激损伤,缓解雄性小鼠生殖损伤,提高精子数量、精子存活率,降低畸形精子率。相同剂量下,ORPSe的生精活性显著优于ORPp。结论:本文以近江牡蛎多糖为实验对象,系统研究其分离、纯化工艺,通过物理及化学方法研究其理化性质,通过建立H2O2诱导TM4氧化应激模型研究其体外抗氧化活性及其作用机制,建立环磷酰胺诱导小鼠氧化应激模型考察近江牡蛎多糖体内生精活性及其作用机制。发现MCM材料是一种理想的除粗多糖中蛋白质的材料,与酶法、冻融法除蛋白各有优势,适合用于需要同时保留活性蛋白及多肽的粗多糖除蛋白;硒化修饰可以将无机硒嫁接进入多糖中形成有机硒多糖ORPSe,ORPSe是无毒物。ORPp及ORPSe体外抗氧化作用机制应该是通过激活TM4细胞中Nrf2/ARE信号通路,促使SOD、HO-1、NQO1等抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶生成,从而提高TM4细胞抗氧化能力。此外,ORPp及ORPSe可能通过激活小鼠睾丸Nrf2/ARE信号通路,提高睾丸对外界抵抗能力,避免因环磷酰胺导致氧化应激损伤,缓解雄性小鼠生殖损伤,且ORPSe活性明显优于ORPp。