目的:苹果茎沟病毒(Apple Stem Grooving Virus,ASGV)是β线性病毒科(betaflexiviridae),发状病毒属(capillovirus)的代表种,正单链RNA病毒,基因组大小6.5kb,寄主范围广泛,可侵染梨、苹果、杏、猕猴桃等多种核果类和仁果类果树,影响着果实的产量和品质,给产业生产带来严重的经济损失。目前,热处理和组织培养相结合是获得无毒苗木采用的主要方式,但其脱毒的分子机制,如高温是否可以激活寄主体内某些基因的表达或一些与病毒互作相关的热激蛋白及与抗病相关的热激信号的转导和信号分子增加等途径不清楚,导致果树脱毒效果不稳定,严重制约了果树病毒病害的有效防治。本研究一方面通过分析热处理条件下砂梨体内抗病相关基因和沉默途径相关基因的表达量,初步分析热处理脱毒的机理;另一方面,构建砂梨“金水二号”品种ASGV分离物(命名为ASGV-Js2)的侵染性克隆,明确其侵染特性,旨在为深入探究砂梨抗病基因的功能提供材料。方法:1.本研究分别对24℃正常培养和37℃热处理培养1d和5d的感染ASGV的砂梨“金水二号”茎尖组织混合样进行RNA-seq测序,并结合生物信息学方法筛选抗病相关差异表达相关基因,并采用q RT-PCR的方法分析其表达量变化。2.采用q RT-PCR方法分析不同温度处理条件下砂梨体内与基因沉默途径相关的差异表达基因(Pp AGO1,Pp AGO2,Pp AGO4,Pp DCL2,Pp DCL4和Pp Rd Rp1)在无毒和感染ASGV两种植株体内的表达量变化,同时构建Pp AGO1,2,4,Pp DCL2 VIGS沉默载体,进一步探究基因沉默途径相关基因的功能。3.通过重叠延伸PCR及同源重组的方法获得ASGV-Js2农杆菌介导的侵染性克隆,通过注射的方式接种昆诺黎和心叶烟,检测其致病性,进而判断构建重组质粒的侵染性。结果:1.从两种温度处理的转录组文库中筛选得到783个差异表达基因,其中531个为上调表达基因和252个为下调表达基因。GO功能分类显示,筛选得到的差异表达基因录属于生物学过程、细胞组分和分子功能三大类别,其中,“代谢途径”,“细胞过程”,“刺激应答反应”等生物学过程所占基因数目居多。KEGG Pathway显著性富集分析表明,代谢通路及次级代谢产物生物合成相关基因显著富集。采用real-time PCR对随机选择的10个差异表达基因,包括具有防御、复制、翻译等功能的5个上调表达基因,以及代谢、转录因子和未知功能蛋白等5个下调基因进行热处理条件下梨茎尖和基部部位表达量分析,结果验证了RNA-seq测序结果的可靠性,同时表明差异基因在茎尖和基部的表达存在组织特异性。热处理条件下病毒mp基因在茎尖和基部表达量均下调,表明高温抑制病毒在植物体内的复制。同时筛选抗病相关基因Pp899,real-time PCR结果表明其在高温条件下上调表达,初步推测其参与抗病途径。2.基因沉默途径相关的差异表达基因表达量分析:首次克隆并获得了来源于砂梨沉默途径相关基因:Pp AGO1,Pp AGO2,Pp AGO4,Pp DCL2,Pp DCL4和Pp Rd Rp1序列。荧光结果显示Pp AGO1,Pp DCL2,Pp Rd Rp1基因的表达在热处理条件下表达量显著上升,推测其参与参与基因沉默途径;Pp AGO2,Pp DCL4基因的表达受高温和病毒共同影响。Pp AGO2 TRV VIGS沉默载体接种烟草后,烟草体内TRV病毒含量下降,表明砂梨基因对病毒的复制和积累有影响,但其作用机制不明确。3.成功构建ASGV-Js2分离物的侵染性克隆,并通过农杆菌介导侵染昆诺黎和心叶烟,结果显示ASGV均可在这两种植株中引起系统侵染。结论:明确了高温条件下砂梨体内病毒积累量下降,且高温条件下筛选得到了与抗病功能相关的差异表达基因Pp899;同时也克隆并分析了高温和感染病毒条件下与基因沉默相关的一些基因(Pp AGO1,2,4,Pp DCL2,4和Pp Rd Rp1)的表达量,初步推测其参与基因沉默途径。ASGV侵染性克隆的构建为进一步研究抗病相关基因功能提供材料。