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羊传染性脓疱病,俗称羊口疮(Orf),是由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起绵羊、山羊的一种接触性、嗜上皮性的传染病,也能感染人和其他动物。Orf临床上以在口唇、鼻、舌、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和痂皮为特征。福建近年来山羊养殖发展很快,偶尔有Orf的案例报道,但缺乏病原的分离鉴定及生物学特性方面的资料。因此,研究Orf在福建省的流行状况、分子遗传特征、不同毒株的致病性,研制安全有效的疫苗等问题成为亟需解决的问题。本研究的内容和结果如下:1.首先在2011年和2012年从福建省多个地区收集疑似羊口疮发病羊的痂皮,利用羊胚胎鼻上皮细胞(Ovine fetal turbinate,OFTu)细胞从8个羊场羔羊唇部痂皮中分离获得8株病毒,并通过PCR扩增ORFV011和ORFV059基因对这8株分离株进行鉴定,分别命名为:OV-GO、OV-SL、OV-YX、OV-SJ1、OV-NP、OV-FQ、OV-DS和OV-GT。对其中的OV-YX分离株进行电镜负染观察、病理组织学和免疫组化等方法进一步鉴定。病理组织学显示,ORFV感染后典型的组织学变化包括表皮过度增生、角化细胞气球样变性和皮肤炎性细胞浸润;免疫组化结果显示,ORFV主要分布于皮肤基底层棘细胞中。并测定其中4株病毒的半数细胞培养物感染量(TCID50),测得 OV-YX P3、OV-GO P4、OV-SJI P3、OV-NP P4 的TCID50分别为:10-6.5/0.1 mL、10-7.6/0.1 mL、10-6.1/0.1 mL和 10-6.7/0.1 mL。2.收集福建省4个地区15个山羊养殖场的349份血清,检测ORFV抗体;并对获得的这一地区10个羊场11株ORFV的ORFV011和ORFV059基因序列分别构建进化树,确定这一地区不同分离株与国内外不同地区ORFV的遗传进化关系。结果发现,基于ORFV011和ORFV059,只有采样点相距1 km的两羊场分离的两株ORFV(OV-GO和OV-GS)具有100%核苷酸同源性,其余9株显示出遗传多样性,地理距离和ORFV011、ORFV059及ORFV011-059遗传距离之间并没有相关性;这一地区ORFV遗传进化上的差异主要与分离株种间差异有关。建立了检测ORFV抗体检测的间接ELISA方法,对福建省15个羊场共349份血清样本检测ORFV抗体,阳性率达64.47%,表明福建省羊群中ORFV感染非常普遍。免疫印迹实验结果表明,ORFV感染后优势抗原为40 kDa的蛋白。3.利用福建ORFV分离株YX株感染OFTu细胞为模型,系统地对ORFV的形态发生学和感染细胞的超微结构变化进行了观察。结果显示,ORFV感染后细胞超微结构变化较大的细胞器有内质网、线粒体、高尔基体和细胞核。感染12 h后,首次在内质网观察到不成熟病毒粒子;感染18 h后,胞浆中可观察到发育不同阶段的病毒粒子,且病毒粒子在高尔基体获得囊膜。病毒粒子一经成熟即朝细胞膜移动,主要通过出芽方式释放病毒粒子。本试验选用OFTu细胞增殖ORFV,确定最佳观察时间是在感染后24 h之内。4.基于ORFV011和ORFV059基因核苷酸序列的进化树及分离株的地域分布,我们选择了4株典型的ORFV毒株(OV-GO、OV-YX、OV-NP和OV-SJ1),通过二代测序技术测定这4株ORFV的全基因组序列,进一步在全基因组水平上分析这些毒株的遗传进化多样性。这4株病毒基因组长度为132～139 kb,编码124至132个开放阅读框,G+C含量约64%,GC含量在整个基因组分布是不均匀的。不同ORFV毒株之间序列差异很大,尤其是头尾两端的序列变异更大,分布在末端的基因同源性较低。病毒株OV-SJ]、OV-GO和OV-YX全基因组序列中,有一个基因001/134基因完全处于基因组的ITR中,但OV-NP的001基因只有部分序列位于ITR,对应的134基因位于非ITR区域启动子发生突变,不形成有编码意义的开放阅读框。基于全基因组序列比较发现,OV-NP缺失了 114到120的基因,共缺7个基因(约5.5 kb),而OV-SJ1缺失了 1 17,118和119基因3个基因(约1.5 kb)。用ORFV编码的每个基因推导的氨基酸序列分别构建进化树,在132个进化树中,基于16个基因的氨基酸的进化树可以很容易鉴定毒株宿主起源于绵羊还是山羊,其中008基因的氨基酸序列具有最高的分辨率。本研究在国内首次完成了宿主为山羊的ORFV全基因组序列,有助于我们理解这一地区ORFV毒株遗传进化的多样性。5.本文还通过动物接种试验比测定全基因组序列的4株ORFV的毒力。结果显示,从临床病变及病程持续时间,还是造成的病理组织学损伤程度,都表明福建这4株ORFV毒力从大到小依次为:OV-GO>OV-YX>OV-SJ1>OV-NP,其中OV-NP和OV-SJ1显示出非常弱的毒性。这4株ORFV基因组比较时,发现OV-NP缺失了 114～120的7个基因,OV-SJ1缺失了 117～119的3个基因,基因缺失的2个毒株显示低毒性,基因完整的2个毒株显示较强的毒性,推测基因缺失导致对山羊的毒力减弱。这2株弱毒株的发现,为进一步研制ORFV弱毒疫苗奠定基础。