蛇毒中含有丰富的生物活性物质，至今在我国已经发现的蛇类约有219种及亚种，其中毒蛇有50种，至今只对其中少数几种粗毒或部份纯化的蛋白组份进行了抗肿瘤作用的研究，绝大部份蛇毒抗肿瘤成份都没有被发现。因此，对蛇毒中生物活性成份的研究与开发一直是我国医药学领域研究的重要课题。 基于上述背景，本论文是以我国华南地区富有的蝮蛇蛇毒为分离样品源，建立快速分离纯化蛇毒蛋白的方法，对蝮蛇蛇毒中分离的蛇毒蛋白组份进行抗肿瘤活性的筛选与评价，旨在发现新的具有生物活性的蛇毒蛋白。 本论文的主要实验结果如下：一、用HPLC法从蝮蛇粗毒中一次性快速分离蛋白组份AHP-4采用大孔径C18反相硅胶柱在高效液相色谱上，0-120min内用流动相三氟乙酸+乙腈进行洗脱，从蝮蛇粗毒中分离得到蛇毒蛋白组分AHP-4。 二、用HPLC法对从蝮蛇粗毒中分离的AHP-4进行了纯度测定。AHP-4在HPLC图谱上为单一对称峰，主峰的相对百分含量为97.1％，表明采用上述分离方法能从蝮蛇粗毒中分离得到高纯度的AHP-4。 三、AHP-4的分子量测定采用高效液相-质谱联用仪对AHP-4进行了分子量的测定。AHP-4分子量为7554Da。 四、AHP-4的蛋白浓度测定根据标准曲线和AHP-4的吸光度值，计算出AHP-4蛋白浓度为0.983μg/ml。五、AHP-4单一肽链结构的测定采用非还原和还原SDS电泳法测定AHP-4的肽链结构。结果显示，AHP-4在非还原和还原电泳条件下均为单一区带，说明AHP-4由单一肽链组成。 六、AHP-4N-端部分氨基酸测定采用Edman降解测序法测定AHP-4N-端第1位至第15位的氨基酸序列，结果显示，AHP-4N-端第1位至第15位的氨基酸序列为GEECDCGSPANPCCD。经GeneBankprotein-proteinBLAST检索及人工检索，在已知蛋白质N-端第1位至第15位氨基酸序列中，未发现与AHP-4氨基酸结构完全相同的蛋白质。而AHP-4N端第1位至第15位氨基酸序列与5种解离素中的氨基酸序列具有高度同源性，表明AHP-4是一种新的解离素同系物 七、AHP-4对体外ADP诱导的兔血小板聚集的作用用ADP作为诱导剂，观察AHP-4在体外对兔血小板聚集的结果表明，AHP-4剂量依赖性的抑制ADP诱导的兔血小板聚集，IC50为4.607nM。 八、AHP-4对人肝癌Hep3B细胞抗肿瘤活性的形态学变化通过细胞形态学变化来观察AHP-4在体外对人肝癌Hep3B细胞的抗肿瘤活性结果表明，AHP-4在3.88μg/ml、16.9μg/ml和33.8μg/ml剂量时，能诱导细胞出现网状结构的病理变化，表现出明显的抗肿瘤活性，并有剂量依赖性。 九、AHP-4对Hep3B细胞抗肿瘤作用机制的探讨基因芯片的结果表明，AHP-4能上调或下调许多与肿瘤生长转移密切相关基因的表达。其中AHP-4抑制五种整合素(integrinα2、α3、α4、β3和β5)基因的表达和促进两种整合素(integrinα6和αv)基因的表达，抑制表皮生长因子EGF和受体EGFR基因的表达，以及抑制基质金属蛋白酶9、组织抑制型基质金属蛋白酶1表达，可能与其抗肿瘤作用的机制有关。 根据上述实验结果，本论文的结论如下：一、本实验采用高效液相方法，从蝮蛇蛇毒中分离出一种新的解离素同系物。结构确认的结果表明，AHP-4的分子量为7554Da，是由一条多肽链组成的蛋白质，N-端第1位至第15位的氨基酸序列为GEECDCGSPANPCCD。经GeneBankprotein-proteinBLAST检索及人工检索，在已知蛋白质N-端第1位至第15位氨基酸序列中，未发现与AHP-4氨基酸结构完全相同的蛋白质。AHP-4N端第1位至第15位氨基酸序列与5种解离素中的氨基酸序列具有高度同源性，表明AHP-4是一种新的解离素同系物。 二、AHP-4在体外能剂量依赖性地抑制诱导剂二磷酸腺苷(ADP)诱导的兔血小板聚集，IC50为4.607nM，说明AHP-4和大多数解离素一样，具有抑制血小板聚集的作用。 三、AHP-4在体外对人肝癌Hep3B细胞有较强的抗肿瘤活性。形态学结果表明，细胞在AHP-4处理后，使单层贴壁生长的Hep3B细胞出现网状样结构的形态学病理变化，随着时间延长，病变加重，直至细胞全部漂浮。AHP-4的上述抗肿瘤活性有明显的剂量依赖性。 四、用基因芯片方法探讨AHP-4抗肿瘤作用机理的初步结果表明，AHP-4能抑制五种整合素(integrinα2、α3、α4、β3和β5)基因的表达，促进两种整合素(integrinα6和αv)基因的表达；并能抑制表皮生长因子EGF和其受体EGFR以及基质金属蛋白酶9、组织抑制型基质金属蛋白酶1的表达。AHP-4诱导的上述基因表达的抑制可能与其抗肿瘤作用的机制有关。