组织蛋白酶(cathepsin)是一类主要存在于溶酶体中的蛋白水解酶。寄生虫组织蛋白酶的功能涉及到寄生虫的营养摄取、生长发育、组织分化、脱包囊/包囊形成、脱鞘出膜、宿主细胞组织入侵及免疫逃逸等过程，是抗寄生虫化学药物及疫苗设计的重要靶分子。本研究采用RACE-PCR及反向PCR等技术方法，首次克隆了对多种海水养殖鱼类有严重危害的单殖吸虫—玫氏新本尼登虫组织蛋白酶L(cathepsin L)基因的全长cDNA、基因组编码序列及上游转录调控序列，并对其氨基酸序列、基因结构及转录因子结合位点进行了序列分析；应用RT-PCR方法对cathepsin L在玫氏新本尼登虫不同发育时期的mRNA表达进行了半定量分析；建立了cathepsin L的原核及真核表达系统，表达和纯化了重组cathepsin L蛋白，并以纯化的重组cathepsin L蛋白制备了高效特异性玫氏新本尼登虫cathepsin L的抗血清。对cathepsin L DNA序列的分析揭示了玫氏新本尼登虫cathepsin L的基因结构及其上游调控序列存在的多个潜在的转录因子结合位点。主要研究结果如下： 1．玫氏新本尼登虫cathepsin L cDNA序列全长1070 bp，其中5’端非翻译区长20 bp，开放读码框长1008 bp，3’端非翻译区长42 bp。推导的cathepsin L前体含有335个氨基酸，其中包括17个氨基酸的信号肽、100个氨基酸的前体肽及218个氨基酸的成熟肽。具有保守的酶活性位点氨基酸残基(C<25>、H<159>和N<175>)及位于前体肽中的ERF/WNIN motif。同源性分析显示，玫氏新本尼登虫的cathepsin L与其它物种的cathcpsin L具有一定的同源性。 2．玫氏新本尼登虫cathepsin L基因组编码序列长2221 bp，由四个外显子及三个内含子组成，外显子的大小依次分别为427 bp、226 bp、161 bp和236 bp，内含子的大小依次分别为102 bp、312 bp和757 bp。 3．对玫氏新本尼登虫不同发育时期的cathepsin L mRNA的半定量RT-PCR检测结果显示，在刚排出虫卵及未出壳的钩毛蚴中没有检测到cathepsin L mRNA的表达，在自由游泳时期的钩毛蚴、童虫及成虫中均检测到其mRNA的表达，而在成虫期的表达量较高。结果提示cathepsin L可能在玫氏新本尼登虫的发育过程中发挥重要的作用。 4．以成熟肽编码序列构建了原核表达载体pET-22b(+)/cathepsin L并在大肠杆菌中获得成功表达。重组蛋白以包涵体形式表达，经变性复性处理后，利用Ni<2+>金属螯合层析柱和Sephadex G-25进行纯化和脱盐，获得的重组蛋白的纯度为96﹪，Western blot结果证实，所获得的重组蛋白为带有6组氨酸标记的重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原，免疫新西兰雄兔，ELISA、Western blot结果显示，制备的玫氏新本尼登虫cathepsin L兔抗血清具有较高的效价和特异性。 5．以编码preprocathepsin L的cDNA序列构建了C末端带有6组氨酸标记的真核表达载体pcDNA3.0/cathepsin L，使用脂质体介导转染并在哺乳动物细胞293T中进行了表达，利用抗6组氨酸抗体及制备的玫氏新本尼登虫cathepsin L兔抗血清进行间接免疫荧光检测。 6．采用反向PCR技术克隆了玫氏新本尼登虫cathepsin L基因5’上游855 bp的序列，分析发现了多个潜在的转录因子结合位点如OCT1、NIT2、GATA3、GATA1、GATA、GKLF、SATB1、TCF11、Nkx2.5、Nkx3.1、Nkx3.2、S8、NF1及CCAAT box，但在克隆到的855 bp上游序列中并不存在TATA box。