论文部分内容阅读
【目的】
脊髓损伤(Spinal Cord Injury, SCI)是一种严重的中枢神经系统疾病，具有高致残率、高死亡率及高严重并发症发生率等特征，一旦发生，给个人、家庭和社会造成极为沉重的经济负担。在药物治疗方面，甲基强的松龙的使用因其可导致多种严重并发症而饱受争议。课题组前期研究发现，萘莫司他(Nafamostat，NM)可在脊髓损伤后抑制炎症反应，减少胶质瘢痕增生，促进运动功能恢复。而凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，在炎症反应中发挥重要作用，可作为调控脊髓损伤微环境失衡的重要靶点。本课题旨在以前期Nafamostat修复脊髓损伤有效性研究结果为基础，进一步明确Nafamostat修复脊髓损伤的用药时间窗，评估用药安全性，并探讨其在脊髄损伤修复过程中的机制。
【方法】
1.大鼠运动功能及神经传导功能检测
选取8周龄雌性Wistar大鼠，体重220g土10g，随机分为3组：假手术组，单纯损伤组和NM组。假手术组仅去除T10椎板;单纯损伤组与NM组制备T10节段脊髓挫伤模型。NM组分为7个亚组，分别在术后7个不同时间点(0 h ，2 h，8 h，12 h，24 h，48 h，5 d )开始干预。术后采用BBB评分评价大鼠运动功能恢复情况;通过神经电生理检测感觉诱发电位(Sensory Evoked Potential，SEP)和运动诱发电位(Motor Evoked Potential，MEP)评价其神经功能恢复情况;
2.大鼠凝血功能检测
选取8周龄雌性Wistar大鼠，体重220g土10g，随机分为3组：假手术组，单纯损伤组和NM组。假手术组仅去除T10椎板;单纯损伤组与NM组制备T10节段脊髓挫伤模型。NM组分为5个亚组，分别在手术后5个不同时间点(0 h， 2 h，8 h，12 h，24 h )开始干预。分别在损伤后2h和24h取静脉血与脊髓组织，通过凝血功能检测和Westernblot评价Nafamostat修复脊髓损伤的安全性。3.Nafamostat修复大鼠脊髓损伤机制研究
选取8周龄雌性Wistar大鼠，体重220g土10g，随机分为3组：假手术组，单纯损伤组和NM组。假手术组仅去除T10椎板;单纯损伤组与NM组制备T10节段脊髓挫伤模型。NM组在术后选取最佳用药时间点开始干预。运用免疫荧光染色检测脊髓组织中Thrombin的表达;通过Westernblot检测脊髓组织凝血酶作用途径信号蛋白(Thrombin、PAR1、STAT3、p-STAT3)表达;通过Westernblot检测星形胶质细胞前体标志物Vimentin的表达，以及运用免疫焚光染色检测脊髓组织中星形胶质细胞的活化情况;采用炎症芯片技术检测炎症因子表达变化。
【结果】
1.Nafamostat修复脊髓损伤用药时间窗为损伤后8-12h
在大鼠脊髓损伤前后利用BBB评分评估运动功能的恢复。持续5w实验结果显示，脊髄损伤后0h-24h开始用药的NM组大鼠，后肢运动功能恢复较单纯损伤组更好，差异具有统计学意义(P<0.05)。其中，损伤后8h及12hNM组大鼠后肢运动功能恢复优于其他NM组和单纯损伤组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。脊髄损伤后5w行神经电生理检测。结果显示，单纯损伤组与NM组MEP与SEP潜伏期较假手术组均有不同程度延长，8h与12hNM组潜伏期延长时间较其余NM组缩短，差异具有统计学意义(P＜0.05)单纯损伤组与NM组大鼠MEP与SEP波幅较假手术组均有不同程度下降，8h与12hNM组波幅降低程度较其余NM组更小，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。
2.脊髓损伤后8h开始进行Nafamostat干预对凝血功能无显著影响
凝血功能(PT、PT活动度、PT-INR等)的检测结果表明，在各NM组中，脊髄损伤后8h开始给药的NM组凝血功能基本与单纯损伤组一致，差异无统计学意义。
3.Nafamostat介导Thrombin-PAR1-STAT3通路修复脊髓损伤
Westernblot结果显示，NM组脊髓组织中凝血酶表达明显低于单纯损伤组;免疫荧光结果显示，单纯损伤组损伤脊髓局部组织中Thrombin+神经元数量较NM组增多，差异具有统计学意义(P<0.05);Westernblot结果显示，NM组中Thrombin，PAR1，STAT3，p-STAT3及Vimentin的表达均较单纯损伤组降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)在损伤5w进行免疫荧光检测，NM组脊髓组织中GFAP+星形胶质细胞数较单纯损伤组明显減少，差异具有统计学意义(P＜0.05);炎症芯片结果显不，脊髓损伤后Nafamostat干预可降低多种促炎因子表达.
【结论】
1.应用Nafamostat修复大鼠脊髓损伤的用药时间窗为损伤后8h-12h，时间窗较甲强龙更宽，更具临床转化意义;
2.在脊髓损伤后8h开始进行Nafamostat干预对机体凝血功能无显著影响，用药安全性较好，进一歩佐证用药时间窗的合理性;
3.脊髓损伤后，Nafamostat可降低损伤组织局部Thrombin的表达及活性，抑制其对PAR1的激活，干扰下游STAT3信号通路传递，降低星形胶质细胞增殖活化，減少胶质瘢痕增生，降低炎症反应，修复脊髄损伤。
脊髓损伤(Spinal Cord Injury, SCI)是一种严重的中枢神经系统疾病，具有高致残率、高死亡率及高严重并发症发生率等特征，一旦发生，给个人、家庭和社会造成极为沉重的经济负担。在药物治疗方面，甲基强的松龙的使用因其可导致多种严重并发症而饱受争议。课题组前期研究发现，萘莫司他(Nafamostat，NM)可在脊髓损伤后抑制炎症反应，减少胶质瘢痕增生，促进运动功能恢复。而凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，在炎症反应中发挥重要作用，可作为调控脊髓损伤微环境失衡的重要靶点。本课题旨在以前期Nafamostat修复脊髓损伤有效性研究结果为基础，进一步明确Nafamostat修复脊髓损伤的用药时间窗，评估用药安全性，并探讨其在脊髄损伤修复过程中的机制。
【方法】
1.大鼠运动功能及神经传导功能检测
选取8周龄雌性Wistar大鼠，体重220g土10g，随机分为3组：假手术组，单纯损伤组和NM组。假手术组仅去除T10椎板;单纯损伤组与NM组制备T10节段脊髓挫伤模型。NM组分为7个亚组，分别在术后7个不同时间点(0 h ，2 h，8 h，12 h，24 h，48 h，5 d )开始干预。术后采用BBB评分评价大鼠运动功能恢复情况;通过神经电生理检测感觉诱发电位(Sensory Evoked Potential，SEP)和运动诱发电位(Motor Evoked Potential，MEP)评价其神经功能恢复情况;
2.大鼠凝血功能检测
选取8周龄雌性Wistar大鼠，体重220g土10g，随机分为3组：假手术组，单纯损伤组和NM组。假手术组仅去除T10椎板;单纯损伤组与NM组制备T10节段脊髓挫伤模型。NM组分为5个亚组，分别在手术后5个不同时间点(0 h， 2 h，8 h，12 h，24 h )开始干预。分别在损伤后2h和24h取静脉血与脊髓组织，通过凝血功能检测和Westernblot评价Nafamostat修复脊髓损伤的安全性。3.Nafamostat修复大鼠脊髓损伤机制研究
选取8周龄雌性Wistar大鼠，体重220g土10g，随机分为3组：假手术组，单纯损伤组和NM组。假手术组仅去除T10椎板;单纯损伤组与NM组制备T10节段脊髓挫伤模型。NM组在术后选取最佳用药时间点开始干预。运用免疫荧光染色检测脊髓组织中Thrombin的表达;通过Westernblot检测脊髓组织凝血酶作用途径信号蛋白(Thrombin、PAR1、STAT3、p-STAT3)表达;通过Westernblot检测星形胶质细胞前体标志物Vimentin的表达，以及运用免疫焚光染色检测脊髓组织中星形胶质细胞的活化情况;采用炎症芯片技术检测炎症因子表达变化。
【结果】
1.Nafamostat修复脊髓损伤用药时间窗为损伤后8-12h
在大鼠脊髓损伤前后利用BBB评分评估运动功能的恢复。持续5w实验结果显示，脊髄损伤后0h-24h开始用药的NM组大鼠，后肢运动功能恢复较单纯损伤组更好，差异具有统计学意义(P<0.05)。其中，损伤后8h及12hNM组大鼠后肢运动功能恢复优于其他NM组和单纯损伤组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。脊髄损伤后5w行神经电生理检测。结果显示，单纯损伤组与NM组MEP与SEP潜伏期较假手术组均有不同程度延长，8h与12hNM组潜伏期延长时间较其余NM组缩短，差异具有统计学意义(P＜0.05)单纯损伤组与NM组大鼠MEP与SEP波幅较假手术组均有不同程度下降，8h与12hNM组波幅降低程度较其余NM组更小，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。
2.脊髓损伤后8h开始进行Nafamostat干预对凝血功能无显著影响
凝血功能(PT、PT活动度、PT-INR等)的检测结果表明，在各NM组中，脊髄损伤后8h开始给药的NM组凝血功能基本与单纯损伤组一致，差异无统计学意义。
3.Nafamostat介导Thrombin-PAR1-STAT3通路修复脊髓损伤
Westernblot结果显示，NM组脊髓组织中凝血酶表达明显低于单纯损伤组;免疫荧光结果显示，单纯损伤组损伤脊髓局部组织中Thrombin+神经元数量较NM组增多，差异具有统计学意义(P<0.05);Westernblot结果显示，NM组中Thrombin，PAR1，STAT3，p-STAT3及Vimentin的表达均较单纯损伤组降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)在损伤5w进行免疫荧光检测，NM组脊髓组织中GFAP+星形胶质细胞数较单纯损伤组明显減少，差异具有统计学意义(P＜0.05);炎症芯片结果显不，脊髓损伤后Nafamostat干预可降低多种促炎因子表达.
【结论】
1.应用Nafamostat修复大鼠脊髓损伤的用药时间窗为损伤后8h-12h，时间窗较甲强龙更宽，更具临床转化意义;
2.在脊髓损伤后8h开始进行Nafamostat干预对机体凝血功能无显著影响，用药安全性较好，进一歩佐证用药时间窗的合理性;
3.脊髓损伤后，Nafamostat可降低损伤组织局部Thrombin的表达及活性，抑制其对PAR1的激活，干扰下游STAT3信号通路传递，降低星形胶质细胞增殖活化，減少胶质瘢痕增生，降低炎症反应，修复脊髄损伤。