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前言 糖尿病(diabetic)的发病率近十年在世界范围内迅速增长,糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病的严重并发症,是导致终末期肾脏病的最常见原因[1]。据报道30-40%的1型糖尿病患者和5-10%的2型糖尿病患者将最终发展到终末期肾病(ESRD)[2]。明确一种阻止这种疾病进一步进展的因素,是一项非常重要的任务。 肾小球硬化症是糖尿病肾脏病的典型病理特征[3]。其主要是细胞外基质蛋白如胶原蛋白及纤维连接蛋白沉积于系膜细胞间质区,并通过降低肾小球毛细血管滤过面积,导致糖尿病肾脏病的进一步进展[4]。既往研究发现,丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B(AKt)在基质沉积中起重要作用,它参与了高糖条件下系膜细胞Ⅰ型胶原蛋白表达上调,并作为一种促纤维化细胞因子被认为在糖尿病肾小球硬化方面扮演重要角色[5,6]。 PI3K/AKt/mTOR信号通路是一条经典信号通路,调节着糖代谢、糖原合成、蛋白合成、细胞增殖、细胞肥大以及细胞死亡[7]等许多细胞功能。据报道PI3K/AKt/mTOR信号通路参与糖尿病肾病的发病[8-11]。 乌索酸(Ursolicacid,UA)是一个来源于植物的五环三萜类化合物,广泛存在于浆果、水果及草药中。具有抗肿瘤、抗肝脏纤维化、降血糖、降血脂及抗动脉粥样硬化作用[12-16]。乌索酸通过抑制PI3K/AKt信号通路活化,抑制Jurkat细胞(恶性肿瘤细胞)增殖,诱导其凋亡[27]从而起到抗肿瘤作用;同时乌索酸通过降低TGF-βmRNA的表达,抑制人肝星状细胞(HSC)增殖,诱导其凋亡,从而缓解肝纤维化的恶性循环;在糖尿病肾病研究报道中发现乌索酸可以通过抑制STAT-3、ERK1/2、JNK通路活化,抑制iNOS过表达,缓解STZ诱导的DN大鼠模型的肾小球肥大和细胞外基质增多,延缓DN的进展[17],但其详细的保护机制目前尚不明确。 本研究用体外培养的人系膜细胞观察高糖刺激对细胞增殖及活性氧簇产生的影响,观察PI3K/AKt/mTOR信号通路的变化,明确乌索酸对系膜细胞的保护作用,进一步探讨乌索酸保护系膜细胞的分子机制。 为此我们设计了以下实验: 目的 1.明确PI3K/Akt信号通路是否参与调节高糖诱导下的系膜细胞增殖及ECM沉积。 2.乌索酸是否对高糖诱导的系膜细胞有保护作用,保护依据是否通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路活化,抑制系膜细胞增殖,抑制TGF-β1表达及ECM沉积。 3.发现乌索酸新的治疗方向,为中草药治疗DN提供新的依据。 方法 将体外培养人系膜细胞分为正常葡萄糖组(NG)、甘露醇高渗对照组(Mannitol)、高糖组(HG)、乌索酸干预组(UA),采用MTT法检测系膜细胞增殖;PI单染流式细胞仪检测细胞周期;AnnexinⅤ-FITC双染流式细胞仪检测系膜细胞凋亡;DCFH-DA测定系膜细胞活性氧簇产生;Western-blot检测系膜细胞PI3K/AKt/mTOR信号通路AKt、p-AKt、mTOR、p-mTOR表达,细胞损伤相关蛋白TGF-β1、FN表达,细胞增殖相关蛋白survivin表达,细胞凋亡相关蛋白Bcl-xl、Bax、survivin表达;实时定量PCR法检测TGF-β1、FN、survivin、Bcl-xl、BaxmRNA表达。 结果 1.HG刺激RMC48h,细胞异常增殖(p<0.05VSNG),UA以剂量依赖的方式抑制HG诱导的系膜细胞增殖(p<0.05VSHG)。 2.UA促进系膜细胞的早期凋亡(p<0.05VSHG),维持细胞正常增殖水平。 3.UA抑制高糖诱导的系膜细胞活性氧簇产生,抑制氧化应激,减少系膜细胞损伤。 4.UA抑制高糖诱导的系膜细胞AKt、mTOR磷酸化水平(p<0.05VSHG),抑制TGF-β1、FN蛋白及mRNA表达(p<0.05VSHG),抑制细胞增殖基因survivin蛋白及mRNA表达(p<0.05VSHG),抑制抗细胞凋亡基因Bcl-xl蛋白及mRNA表达(p<0.05VSHG),增强促细胞凋亡基因Bax蛋白mRNA表达(p<0.05VSHG),减少系膜细胞损伤。 结论 乌索酸通过促进系膜细胞早期凋亡,抑制系膜细胞增殖及活性氧簇产生,抑制高糖介导的PI3K/AKt/mTOR信号通路活化,减少系膜细胞损伤。