[研究背景]烧伤,尤其是大面积烧伤将引起机体一系列的免疫病理生理学变化,造成机体免疫功能紊乱(immune dysfunction)。烧伤后免疫功能紊乱被认为是引发全身炎症反应综合征(SIRS)、严重感染、多器官功能障碍综合征(MODS)甚至死亡等的重要原因。烧伤后免疫功能紊乱是烧伤后创面疼痛刺激、应激(stress)、缺血缺氧(ischemia、hypoxia)及再灌注损伤(reperfusion injury)等因素激活机体的凝血、纤溶、激肽和补体系统,连同患者自身因素及后续的各种治疗因素一起改变了机体免疫细胞和免疫分子所处的微环境,从而导致了免疫功能紊乱的发生。烧伤后免疫功能紊乱发生、发展机制极其复杂并难以得到有效调控,它也被认为是近年来严重烧伤治愈率难以进一步提高的主要原因。目前烧伤免疫研究多是对免疫细胞、免疫因子的作用机制或细胞凋亡、感染及器官损伤等方面的研究。这些研究或多或少的揭示了烧伤后免疫功能紊乱的发生机制。但是烧伤后的病理生理学变化是时间序贯性的,其发生、发展机制十分复杂几乎涉及所有身体器官和系统。因此,深入研究烧伤后免疫功能紊乱的发生机制,对了解烧伤后免疫功能紊乱的发生发展、寻找治疗及诊断的新药物、提高患者生存质量具有深远意义。随着分子生物学技术的不断发展,新的研究手段不断涌现。尤其是在后基因组时代,系统性、整体性越来越受到人们的重视。因此,从基因组层次了解烧伤后的病理生理学过程将是今后烧伤免疫研究的重点。生物信息学(Bioinformatics)是生命科学领域中的新兴学科,面对人类基因组计划所产生的海量生物学数据,生物信息学成为当代生命科学研究的一个前沿领域和重要的方法及工具。与生物信息学相伴发展的基因芯片技术是生物技术领域最重要的进展之一,是推动生物学研究走进系统生物学时代的重要因素和技术基础,它使得获取实验数据的能力大大增强。以基因芯片为代表的高通量分子生物学技术,可以一次进行成千上万基因表达的检测。基因芯片及生物信息学技术为烧伤后免疫功能紊乱机制的研究提供新的研究前景,因其高通量的特性,它可以同时检测数以千计的基因表达情况,可以对烧伤后免疫细胞基因组转录水平信息进行分析,并对研究涉及的基因通路或者基因网络、模块的变化进行分析挖掘。基因芯片及生物信息学技术为烧伤后免疫功能紊乱机制的研究及诊断提供了新的思路。基因芯片技术和生物信息学分析方法为从转录水平或DNA层次全面了解烧伤后复杂的病理生理学变化提供了可能。在2010年Lars H. Evers, Dhaval Bhavsar等人就已经提出：烧伤后基因表达分析是未来一个潜在的研究热点,基因芯片从细胞整体基因组水平出发,能为烧伤后免疫紊乱机制的研究提供新的思路及新的治疗靶点。因此,进行烧伤后基因表达分析,不仅可以从细胞整体基因组转录水平上了解烧伤后一系列的病理生理学变化,而且可以应用基因芯片技术为临床治疗提供新的治疗靶点和思路。目前基因芯片技术应用于烧伤领域的研究已比较常见,2008年JamesA和Lederer等就利用基因芯片技术对创伤及烧伤后小鼠免疫细胞转录组数据的分析中发现烧伤后可引起免疫系统、炎症反应等多个方面的变化。2010年Arul Jayaraman和Robert J等利用基因芯片技术对人烧伤后基因的序贯性变化做出了初步探究。通过对这些芯片数据的初步分析,发现了许多值得深思及颠覆性的信息,如烧伤与创伤、肿瘤不同；烧伤的时间序贯性强、反应更复杂,涉及炎症、免疫反应、代谢等多方面因素。这些研究揭示了烧伤后免疫细胞转录水平的变化；并发现了许多与常规实验及临床研究结果不同的结论,如创伤后免疫细胞基因改变早于4小时发生并持续较长时间；烧伤后基因变化是序贯性而且是有序进行；烧伤后引起大量炎症因子释放,造成免疫细胞功能抑制,且发现固有免疫系统与适应性免疫系统功能抑制的发生无先后之分等。但目前大部分基因芯片研究多用于验证某些基因的表达情况,这一研究方法缺点较多,芯片数据可信度较差,无法进行有效的数据挖掘与分析。现阶段烧伤相关的大规模芯片研究较少,在烧伤免疫方面的研究中更是少见。同时由于烧伤后病理生理学变化是一个动态的过程,其发生、发展机制不同于肿瘤及其他疾病,其分析方法较为复杂、特殊。基因芯片技术在烧伤领域的应用还处于初始阶段,芯片产生的大量的数据并未得到很好的利用,且目前尚没有对烧伤免疫基因芯片产生的数据进行生物信息学方面的精细分析及挖掘。[研究目的]在本次研究中,我们通过系统生物信息学技术获取小鼠烧伤早期不同时间点差异基因表达谱,并运用生物信息学方法分别在GO语义、KEGG通路和蛋白互作网络中初步探索烧伤后免疫功能改变的分子机制,并筛选潜在的生物靶标。旨在初步探索和描述烧伤后免疫细胞差异表达谱、病理过程和分子机制；并通过富集分析锚定与烧伤后免疫功能紊乱发生、发展有关的风险基因及通路；为深入研究烧伤后免疫功能紊乱的发生机制、并筛选早期预警指标和治疗靶点提供理论指导和依据。[研究方法]1原始数据筛选从NCBI的GEO (Gene Expression Omnibus)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)筛选出GSE7404(小鼠,25%TBSA,三度)数据集,GSE7404数据是GPL1261平台Affymetrix Mouse Genome 430 2.0Array基因芯片。基因芯片数据经过质量评估合格后进行下一步数据处理。在R语言环境中应用线性模型方法(linear models method)、经验Bayes算法(empirical Bayes methods)和RSN (Robust Spline Normalization algorithm)分别对探针水平的信号值进行质控、变异稳定性分析、背景矫正、数据归一化和基因注释,将数据最终转化为表达水平数据。2差异表达基因的获取及聚类分析：差异基因获取采用配对样本t检验,差异基因需同时满足p-value<0.01及表达量变化超过2倍的标准,以确保所获取的差异基因即有统计学意义又有生物学表达意义。同时通过无监督聚类分析将差异基因进行分类。3功能富集分析在本次研究中,为我们应用GO-function数据包可以对基因进行功能注释,以有效的处理GO功能中的冗余,使分析结果更加可靠精确。应用DAVID数据库(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)对基因数据进行KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。以筛选在对烧伤后免疫功能紊乱中重要的生物学过程及通路。4烧伤后第一天差异表达基因蛋白互作网络构建及分析将烧伤后第一天所获取的差异表达基因应用STRING9.1数据库构建蛋白互作网络(Protein-protein interaction network)。网络分析及MCL网络模块分析采用生物图表可视化工具Cytoscape软件。并应用BinGO2.44对网络模块进行Gene Ontology功能富集分析。5免疫系统过程差异表达基因的筛选及原始蛋白互作网络的构建应用DAVID网络数据库对不同时间点的差异表达基因进行Gene Ontology (GO)功能富集分析。选取EASE (Expression Analysis Systemic Explorer)< 0.05的生物学功能,并将差异表达基因根据功能富集结果进行分类。原始差异表达基因蛋白互作网络的构建由DAVID及STRING数据库进行。首先将不同时间点的差异表达基因经DAVID基因转换工具(Gene ID Conversion Tool)进行基因ID转换；将转换后的基因输入STRING9.1数据库并选取中等可信度的互作关系(交互作用评分大于0.4)构建差异表达基因的原始蛋白互作网络。6免疫相关基因的选取及蛋白互作网络分析将经过Gene Ontology (GO)功能富集分析所选取的免疫系统过程相关基因映射到各时间点的原始蛋白互作网络中构建免疫相关基因的蛋白互作网络。免疫相关网络分析及MCL网络模块聚类分析采用生物图表可视化工具Cytoscape软件进行,并应用BinGO2.44对网络模块进行Gene Ontology功能富集分析。7小鼠烧伤后不同时间点的蛋白表达水平检测选用7-8周龄的雄性BALB/c小鼠20只,正常饲养1周后,随机分成四组。a组为正常对照组、37度温水；b组为25%III。烫伤组；烫伤小鼠用1.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,均剔除背毛,热水烫伤,深度为(III。／深II。)(病理证实),烫伤后即刻给予生理盐水腹腔注射抗休克。正常组4只不做处理,直接处死取血；烫伤组分别在烫伤后2h、6h、12h、24h处死取血每组4只,Western blotting检测小鼠全血游离免疫细胞中相应的的蛋白表达水平。8统计分析采用开源统计软件R 3.01及SPSS 19.0统计软件进行数据分析。芯片数据处理及分析应用开源统计软件R 3.01进行。其中差异表达基因的获取采用配对样本t检验；基因本体学、KEGG通路分析及蛋白互作网络分析采用由超几何算法及应用Benjamini-Hochberg方法对数据进行矫正。western blotting数据采用均数±标准差(x±s)表示,配对样本组间比较采用配对样本t检验,各组之间的比较采用One Way ANOVA方法。检验水准：P<0.05有统计学意义。[实验结果]1统计分析总共有2725个差异表达基因被选出,在烧伤后2h组和烧伤后1d组差异表达基因以下调基因为主,而烧伤后3d和7d组则以上调基因为主,其中差异表达基因在小鼠烧伤后第1天变化最为显著,共筛选出1825个差异表达基因,其中上调基因658个,下调基因1167个。在烧伤后2小时差异表达基因即发生明显变化,同时聚类分析发现烧伤后基因在转录层面的变化并不是杂乱无章的。2 GO功能富集分析结果烧伤后2h组下调基因富集于是免疫系统过程(p-value=4.27E-08)在烧伤后1d组上调差异表达基因富集于应对刺激反应(46%)、代谢过程(60%)、免疫系统过程(16.6%)、细胞过程(75.5%)、生物调节(58.4%)及死亡过程(18.2%)等生物学过程中；而下调基因明显富集于细胞过程(56.8%)、代谢过程(47.1%)、应对刺激反应(25.7%)、免疫系统过程(13.2%)等四个生物学过程中。在烧伤后第3d组差异表达基因富集于应对刺激反应(43.8%)及免疫系统过程(18.1%)等生物学过程中。而烧伤后第7天上调基因富集于免疫系统过程(21.9%)、应对刺激反应(43.8%)及死亡(15.6%)等生物学过程中。3 KEGG通路分析在烧伤后2h组下调基因主要富基于免疫系统相关通路(Natural killer cell mediated cytotoxicity和T cell receptor signaling pathway)和信号分子及其相互作用相关通路(Cytokine-cytokine receptor interaction)。在烧伤后1d组有36个通路符合阈值要求并被显著富集。上调基因富集通路主要为免疫系统相关通路(Toll-like receptor signaling pathway; NOD-like receptor signaling pathway; T cell receptor signaling pathway; RIG-I-like receptor signaling pathway等)；细胞过程中的细胞生长与死亡先关通路(p53signaling pathway; Apoptosis; Cell cycle);环境信息进程中的信号转导相关通路(MAPK signaling pathway; Jak-STAT signaling pathway; mTOR signaling pathway)。烧伤后1天下调基因主要富集与免疫相关通路(B cell receptor signaling pathway; Primary immunodeficiency; T cell receptor signaling pathway; Antigen processing and presentation; Natural killer cell mediated cytotoxicity等12个通路)及代谢相关通路中的氨基酸代谢(Valine, leucine and isoleucine degradation及Tryptophan metabolism)等通路相关。第3d组上调基因主要富集于代谢相关通路包括氨基酸代谢(Glutathione metabolism)核苷酸的代谢(Purine metabolism Pyrimidine metabolism)及碳水化合物代谢(Starch and sucrose metabolism)等,而第7d组上调基因主要富集于免疫系统相关通路(Toll-like receptor signaling pathway Hematopoietic cell lineage NOD-like receptor signaling pathway)及代谢相关通路(Glutathione metabolism, Nicotinate and nicotinamide metabolism Type Ⅱ diabetes mellitus等。4蛋白互作网络分析通过对烧伤后第一天的差异表达基因构建蛋白互作网络并对网络进行模块化分析显示：Stat1 (down), Jun (up),Lck (down),Cd 19 (down),Sash3 (down),Chekl (up), Cd79a (down)等7个基因不仅在(1day)原始网络中具有最大互作关系,而且在MCL网络模块中位于中心位置是潜在的治疗靶标。5免疫相关蛋白互作网络构建及分析通过对不同时间点差异表达基因进行功能富集分析,筛选出了不同时间点免疫系统功能相关差异表达基因,通过分析显示：Lck, Myd88, Tlr2,Ccr2等4个基因在烧早期MCL网络模块中位于中心位置。并通过免疫印迹验证了Myd88, Lck蛋白在小鼠烧伤早期免疫细胞的表达情况。[研究结论](1).烧伤后2小时小鼠免疫细胞在转录水平即发生明显变化,其中在烧伤后第1天变化最显著,且这一变化并不是杂乱无章的,而是有一定规律可循的；(2).烧伤早期免疫细胞生物调节及死亡(凋亡)等生物学功能增强；烧伤早期免疫细胞即存在免疫系统过程、代谢过程、应对刺激反应、细胞过程等多种生物学功能的紊乱；其中免疫系统过程及刺激反应等功能改变贯穿烧伤早期全程。(3). Statl, Jun, Lck, Cd19, Sash3, Chekl, Cd79a等7个基因可能在烧伤早期多功能紊乱的发生中起着重要的作用,是烧伤后多功能紊乱潜在的早期诊断的生物靶标。(4). Lck, Myd88, Tlr2, Ccr2等4个免疫相关基因可能在烧伤后免疫系统功能变化过程中起着重要的作用,是烧伤免疫系统功能变化潜在的诊断与治疗靶标。