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F18+大肠杆菌病原菌易引起断奶仔猪的腹泻、生长迟缓和死亡,从而给养猪业造成巨大的经济损失,但遗憾的是至今仍没有效的疫苗和防治措施。F18+大肠杆菌引起仔猪感染的致病机理,目前认为F18菌毛和毒素是其已知的两个毒力因子,其中F18菌毛介导其对宿主细胞的黏附,毒素则是通过增加分泌和减少吸收来改变肠细胞的功能而发挥致病作用。通常认为鞭毛是细菌的运动器官,为细菌提供运动的动力,但近年来的研究陆续证明其与病原菌的致病力相关。通过试验我们发现F18ab和F18ac大肠杆菌标准株都具有良好的运动性,而至今有关F18+大肠杆菌致病机理研究的模型中都未曾提到过鞭毛在其中的作用。本研究以鞭毛为切入点来探讨F18+大肠杆菌鞭毛与其致病性之间的关系。基于编码F18+大肠杆菌鞭毛素的fliC基因、编码F18菌毛主要结构亚基的fedA基因和编码鞭毛马达的motA基因的已知序列,本试验利用λ噬菌体-Red同源重组系统对F18+大肠杆菌的两个标准株F18ab(Wild-type, O139:H1:F18ab, Stx2e)和F18ac (Wild-type, O157:H19:F18ac,4P-, STa+, STb+)的上述基因进行敲除。首先将含有fliCfedA和motA基因同源臂片段和Cat(氯霉素抗性基因)表达盒的PCR扩增产物,电转化至已经转化有pKD46质粒的F18ab和F18ac大肠杆菌中,在Red同源重组酶的作用下,借助两端与靶基因两翼同源的序列与染色体上对应区域发生重组,实现一步法构建F18ab/ac△fliC::Cat, F18ab/ac△fedA::Cat和F18ab/ac△motA::Cat突变株。在二次重组中利用温度敏感性、编码Flp重组酶的质粒pCP20,从而消除Cat抗性基因标志。通过PCR鉴定及DNA测序结果证明了上述缺失株的成功构建。在表型试验中,其中fliC缺失株在半固体培养基上缺乏运动性、电镜下观察无鞭毛形态和用Western Blot检测不到鞭毛素的表达。motA缺失株细菌表面虽能观察到鞭毛形态但在半固体培养基上缺乏运动性。fedA缺失株不能与F18ab单克隆抗体发生可见的凝集反应。FliC和fedA双缺失株是在△fliC缺失株的基础上利用同源重组系统继续缺失fedA基因构建而成的。该双缺失株既不能在半固体培养基上运动也不能与F18菌毛的多克隆抗体发生肉眼可见的凝集反应。fliC、fedA、motA及fliCfedA基因缺失株的成功构建,有助于深入研究F18+大肠杆菌的致病机理。通常,细菌对肠上皮细胞起初的黏附及后续的定植被认为是肠道疾病发病机制中关键的第一步。尽管鞭毛介导了多种病原体对宿主细胞的黏附,但还不清楚其是否在F18+大肠杆菌黏附宿主细胞的过程中发挥作用。本研究通过比较鞭毛缺失株、F18菌毛缺失株、motA缺失株及鞭毛和F18菌毛双缺失株与野生株对两个体外仔猪肠上皮细胞,IPEC-1和IPEC-J2细胞的黏附能力发现,鞭毛缺失株及鞭毛和F18菌毛双缺失株对上述两个细胞系的黏附能力都显著下降(P<0.05),而F18菌毛缺失株的黏附能力并无明显的变化。当把编码鞭毛马达的motA基因缺失后构建了有鞭毛形态但不能运动的F18+大肠杆菌菌株,其黏附能力同样也下降,说明鞭毛介导的运动性在F18+大肠杆菌对宿主细胞的黏附过程中同样起重要的作用。进一步的研究发现,1：10的多克隆H1或H19抗体分别能抑制随后F18ab或F18ac大肠杆菌对宿主细胞的黏附,而用间接免疫荧光试验证明纯化的鞭毛也能直接与肠上皮细胞结合。以上结果都说明了F18+大肠杆菌鞭毛本身具有黏附特性。另外,通过荧光定量PCR试验发现,鞭毛缺失后能使Ⅰ型菌毛的表达量增加了约2倍,F18菌毛及AIDA-I分别增加了约1.3和1.4倍,从而揭示了细菌菌体表面的各附属结构是协调表达的。以上结果证明了F18+大肠杆菌鞭毛介导了其起初对宿主细胞的黏附。鞭毛在介导黏附时,主要通过两方面发挥作用。一方面,鞭毛通过其运动性,非特异性的增加F18+大肠杆菌与宿主细胞之间相互接触的机率,从而促进黏附。另一方面,鞭毛本身能作为一种黏附素,直接特异性地与宿主细胞上的鞭毛受体结合而参与黏附。鞭毛及鞭毛介导的运动性是许多具有侵袭能力的致病菌的重要侵袭因子通过研究F18ab E. coli和F18ac E. coli对IPEC-J2和IPEC-1细胞的侵袭能力发现,和其他的ETEC一样,F18ac E. coli没有侵袭能力,而F18ab E. coli对这两个细胞都具有侵袭能力。与野生株相比,E. coli F18ab△fliC对IPEC-J2和IPEC-1细胞的侵袭能力都显著下降。其中fliC缺失后使F18ab E. coli对IPEC-J2细胞的侵袭减少了约91%,对IPEC-1细胞的侵袭也减少了约63%。回复株的侵袭能力得到了部分恢复。在37℃时F18ab E. coli鞭毛的表达量比在30℃时更多,其侵袭能力也更强。本研究首次发现了F18ab E. coli具有侵袭能力,并证明鞭毛是其重要的侵袭因子。细菌生物被膜是细菌为了适应不良的生存环境,而与处于浮游状态的单个细菌相对的一种生存方式。大多数致病菌在一定的条件下都能形成生物被膜。在本研究中我们发现,F18ab E. coli和F18ac E. coli在体外都具有形成生物被膜的能力,且F18ab E. coli形成生物被膜的能力比F18ac E. coli强。鞭毛及鞭毛介导的运动性是影响生物被膜形成的重要因素之一。与野生株相比,F18ab E. coli鞭毛缺失株在IPEC-J2细胞上只能形成小的微菌落,在试管中形成生物被膜的能力也减弱。而即使是野生型F18ac E. coli在IPEC-J2细胞上形成的微菌落也比较少,与此相应的在试管中形成生物被膜能力也较弱。当鞭毛缺失后,其在试管中仅能形成很薄的一层生物被膜。通过生物被膜定量试验进一步证明,鞭毛缺失后使F18ab E.coli和F18ac E. coli形成生物被膜的能力都显著下降。以上结果说明了鞭毛在F18+E. coli体外生物被膜和微菌落形成中起重要的作用。单体的细菌鞭毛素蛋白能通过Toll-like receptor5(TLR5)信号途径诱导机体促炎性细胞因子IL-8的产生。本研究通过比较F18+E. colifliC缺失株、fedA缺失株及fliCfedA双缺失株在体外Caco-2细胞模型中引起IL-8产生的能力发现,所有的这些缺失株诱导IL-8产生的浓度都下降。FliC缺失株诱导IL-8产生的能力减少了约68%,fedA缺失株减少了约43%,而fliCfedA双缺失株则减少了约86%。以上结果说明了鞭毛素蛋白是F18+E. coli在体外诱导诱导IL-8产生的主要因素,也首次证明了F18菌毛在体外也能诱导IL-8的产生总之,上述试验结果证明了F18+E. coli鞭毛是其在体外有效的黏附、生物被膜形成及刺激体外肠上皮细胞产生IL-8所需要的。F18ab E. coli鞭毛是其重要的侵袭因子,是其有效侵袭上皮细胞所需要的。由于鞭毛蛋白本身具有良好的免疫原性及其在F18+E. coli致病过程中的重要作用,鞭毛蛋白将来可作为发展预防F18+大肠杆菌引起感染的有效侯选疫苗。