晚期糖基化终产物(Advanced glycation end products,AGEs)是在蛋白质赖氨酸的氨基和还原糖的醛基之间发生的不可逆的非酶性糖基化反应生成的终产物的总称,是随着年龄的增长聚集于血浆和组织的一组性质各异的分了。在多种病理条件下会加速AGEs的形成和聚集,特别是在糖尿病的发生发展中,AGEs起了重要的作用,体内AGEs水平的高低直接关系到糖尿病并发症的严重程度。AGEs可能通过多种途径改变细胞的成分来发挥作用,同时它也可产生直接效应,包括它可介导细胞外相邻的无关蛋白质互相交联。不仅如此,在内皮细胞、单核细胞、血管平滑肌细胞等多种细胞上,AGEs与其受体(RAGE)结合后可激活诸如p21ras,MAPKs及核受体NF-κB等信号通路,从而发挥多种生物学效应。我们前期的研究已经证实,AGEs可通过激活p38 MAPK途径改变内皮细胞骨架肌动蛋白F-actin的形态,以及显著增加单层内皮细胞通透性。但MAPK等信号并不直接导致F-aetin的功能改变,所以AGEs对内皮细胞功能的影响还需要其它连接蛋白的中介来实现。ERM(Ezrin/Radixin/Moesin)蛋白分别是Ezrin(埃兹蛋白)、Radixin(根蛋白)和Moesin(膜突蛋白),是一种细胞骨架—膜连接蛋白,参与了细胞黏附、微绒毛形成、细胞运动等多种细胞功能的调节。ERM蛋白的结构和功能在不同种属间具有高度的同源性,属于血红蛋白4.1超家族。ERM蛋白在氨基末端有一个同源性很高的FERM功能域(FERM domain),在羧基末端的不同氨基酸位置上有一个关键的、与其激活有关的苏氨酸磷酸化位点,其中Ezrin是T567,Radixin是T564,Moesin是T558。ERM功能调节的一个重要环节就是苏氨酸残基的磷酸化。Rho激酶和p38 MAPK可能参与了ERM羧基末端苏氨酸的磷酸化,但尚无直接的证据支持。已有研究证明,内皮细胞主要表达的ERM蛋白为Moesin。目的:本研究试图证明AGEs通过Moesin蛋白苏氨酸磷酸化使其活化,进而引发F-actin构像的改变和内皮细胞屏障功能的障碍,为进一步阐明糖尿病血管并发症的发生机制提供实验依据,并为其防治提供新的思路和有效的手段。方法:本课题以人皮肤微静脉内皮细胞株HMVEC及游离的SD大鼠皮肤微血管为研究对象,在细胞和组织两个层面,应用细胞培养、免疫印记、siRNA干扰、RT-PCR、细胞免疫组化、单层内皮细胞通透性的测定、游离微静脉血管通透性的测定等方法,通过观察AGEs刺激下Moesin蛋白表达和磷酸化水平和定位的变化,及其对内皮细胞骨架形态、屏障功能和血管通透性的影响,阐明Moesin在AGEs介导的内皮细胞形态和功能变化中的作用。AGE修饰的人血清白蛋白(AGE-modified human serum albumin AGE-HSA),由人血清白蛋白与葡萄糖共孵育8周制得。在细胞水平的研究中,人皮肤微血管内皮细胞分别接种于100mm培养皿,微孔小皿(petri dish)和铺有1%明胶的双层通透的培养皿(transwell)顶层小室微孔膜上(直径6.5 mm,孔径大小0.4μm),待细胞长至融合后,换无血清培养基2h使细胞获得同步生长。用不同浓度的AGE-HSA与细胞在体外共同培养不同时间,并设立HSA阴性对照组进行比较。在各实验处理组中,分别用可溶性RAGE的抗体(anti-RAGE IgG)、Rho激酶抑制剂(Y-27632)、p38抑制剂SB203580、ERK通路抑制剂PD98059及JNK通路抑制剂SP600125,预处理内皮细胞;或用重组腺病毒MKK6b,p38α,p38β的无活性型突变体预转染内皮细胞,均继以AGE-HSA培养1h。采用western blot技术检测Moesin蛋白表达和磷酸化Moesin水平的变化,荧光染色法观察细胞骨架蛋白的形态学改变,TRITC荧光标记白蛋白漏出法测定单层内皮细胞的通透系数Pa值,siRNA技术下调Moesin的表达。在组织水平的研究中,用不同浓度的AGE-HSA灌注游离大鼠皮肤微静脉测定微静脉对荧光标记白蛋白的通透性,荧光标记白蛋白通过血管壁的扩散通量以通透系数Pa表示。用RAGE抗体、Rho激酶抑制剂Y-27632、p38 MAPK抑制剂SB203580预灌流,或通过尾静脉注射腺病毒的方法进行干预,以评估RAGE、Rho激酶及p38 MAPK在AGEs诱导的内皮屏障功能中的作用。主要结果:结果:1.AGE-HSA可以时间剂量依赖方式引起游离微静脉通透性的增高插管并测量基础通透系数后,分别用不同浓度(12.5、25、50、100μg/ml)的AGE-HSA或100μg/ml的HSA灌流游离微静脉120 min,并每隔15～30 min记录一次通透系数。所得Pa值均与自身基础Pa值相比较,并乘以100%。基础Pa设为100,即为每组的自身对照。结果显示AGE-HSA作用于游离微静脉可使其通透性随时间延长而增高。100μg/ml的AGE-HSA使微静脉通透性在30 min时就与对照存在显著性差异(P＜0.05),并持续升高至120 min。从45 min起,50μg/ml的AGE-HSA也使微静脉通透系数与对照有显著性差异(P＜0.05),并持续升高至120 min。12.5和25μg/ml的AGE-HSA组的各时间点的通透系数与其自身对照相比均未产生明显差异(P＞0.05)。未经修饰的HSA对微静脉通透性无影响,各组与对照及组间的作用差异均无统计学意义(P＞0.05)。2.siRNA技术证明Moesin参与了AGEs介导的HMVEC形态和功能变化(1) siRNA干扰技术抑制了Moesin及ERM蛋白在HMVEC的表达:转染Moesin siRNA 48h可显著下调Moesin mRNA的表达水平,并使Moesin蛋白和ERM蛋白的表达与对照相比分别降为34±8%和38±9%。转染control siRNA则无此作用。证明本实验所用的siRNA实验体系可以有效的下调Moesin的表达,并且证明在内皮细胞中主要表达的ERM蛋白为Moesin。(2)干扰Moesin表达后可抑制AGE-HSA刺激引起的细胞功能和形态变化:转染control siRNA和Moesin siRNA的内皮细胞,均显示F-actin主要分布在细胞周边,线条完整连续,显示出内皮细胞的典型的鹅卵石样轮廓。细胞间连接紧密,未见明显缝隙形成。预转染control siRNA的内皮细胞,再继以50μg/mlAGE-HSA作用1 h,F-actin外周致密带边缘变得毛糙不规整,出现锯齿样断裂,趋于变细崩解消散,F-actin在胞浆内弥散分布,形成由非极性单行排列的肌动蛋白丝组成的应力纤维。而预转染Moesin siRNA的内皮细胞,则可抑制AGE-HSA对F-actin形态学的改变,证明Moesin蛋白参与了AGEs诱导的细胞骨架蛋白形态学改变的过程。用Transwell方法测单层内皮细胞的通透性。结果显示,100μg/ml AGE-HSA作用1h可显著增加内皮细胞的通透性,而HSA则无此作用。预转染MoesinsiRNA可显著降低AGE-HSA所诱导的高通透性,Pa值从152.6±8.7%降为114.2±8.1%(P＜0.05),预转染control siRNA则无此作用,且Moesin siRNA本身对内皮细胞通透性无影响。siRNA干扰Moesin表达后,AGE-HSA介导的内皮细胞形态和功能变化被抑制,证明Moesin通过磷酸化参与了AGE介导的内皮细胞反应。3.AGE-HSA时间和剂量依赖性地介导Moesin的磷酸化(1)用western blot的方法检测AGE-HSA刺激后HMVEC胞浆内Moesin蛋白表达和磷酸化Moesin(T558)水平的变化,发现50μg/ml AGE-HSA刺激后不同时间(5、10、20、30、45、60、120 min)Moesin蛋白表达无明显改变,而磷酸化Moesin于刺激后45 min开始增加,60～120 min达高峰。检测不同浓度的AGE-HSA(12.5,25,50,100,200μg/ml)刺激内皮细胞1h,发现Moesin蛋白表达无明显改变,而磷酸化Moesin于50μg/ml AGE-HSA刺激后开始增加,200μg/ml时达高峰。不同浓度和时间HSA刺激后,Moesin蛋白表达和其磷酸化水平均无明显改变。(2) AGE-HSA可以时间剂量依赖的方式引起ERM蛋白的磷酸化,而对ERM蛋白的表达没有影响。(3) siRNA干扰Moesin表达后,AGE-HSA刺激没有使Moesin磷酸化增多:预先转染Moesin siRNA可显著降低AGEs所诱导的Moesin磷酸化水平的升高,而预转染control siRNA则无此作用。4.AGE-HSA通过与RAGE结合介导Moesin磷酸化及内皮细胞功能障碍(1)预孵育100μg/mi RAGE抗体1 h,再给予50μg/ml AGE-HSA作用1 h,结果显示RAGE抗体可有效减少AGE-HSA所致Moesin磷酸化。预先加入RAGEAb(100μg/ml)1h,继以100μg/ml AGE-HSA作用1h,可显著降低AGE-HSA诱导的单层内皮细胞通透性的增高,使Pa值由152.6±8.7%降为118±5.5%(P＜0.05)。(2)在组织水平,插管并记录基础通透系数后,用RAGE Ab(50,100μg/ml)预灌流微静脉1h,记录其通透系数,冲洗并更换为含50μg/ml的AGE-HSA的灌流液继续灌流1h,再次记录通透系数。所得Pa值分别与其自身的基础Pa值比较,得到相对Pa值。RAGE Ab可以剂量依赖的效应降低AGE-HSA诱导的血管高通透性(P＜0.05),抗体本身对血管通透性无影响。证明AGE-HSA通过与受体RAGE结合介导Moesin磷酸化和对内皮细胞功能的影响。5.AGE-HSA可诱导ROCK和p38的磷酸化AGE-HSA可使磷酸化的ROCK和p38 MAPK表达显著增高,HSA则无此作用。且用Moesin siRNA使Moesin表达减少,并不能抑制AGE-HSA诱导的ROCK磷酸化的增多,提示ROCK和p38 MAPK通路参与了AGEs对内皮细胞功能的影响,且ROCK是在Moesin的上游发挥作用。6.ROCK参与了AGE-HSA引起的Moesin磷酸化及内皮细胞功能障碍(1)预先加入ROCK抑制剂Y-27632(25μmol/L)30 min,再给予50μg/mlAGE-HSA作用1h,可有效减少AGE-HSA所致Moesin蛋白磷酸化。预先加入Y-27632(25μmol/L)30 min继以100μg/ml AGE-HSA作用1h,可显著降低AGE-HSA诱导的单层内皮细胞通透性的增高,使Pa值降为124.9±7.2%,(P＜0.05)。(2)在组织水平,插管并记录基础通透系数后,用Y-27632(10,25μmol/L)预灌流微静脉30 min,继以含50μg/ml的AGE-HSA的灌流液继续灌流1h,可使Pa值分别降至188.2±26.2%和165.7±30.2%,显示出剂量依赖效应(P＜0.05)。抑制剂本身对血管通透性无影响。证明ROCK参与介导了AGE-HSA引起的Moesin磷酸化和对内皮细胞功能的影响。7.p38通路参与了AGE-HSA引起的Moesin磷酸化及内皮细胞功能障碍(1)预先加入p38 MAPK抑制剂SB203580(25μmol/L)30 min,再给予50μg/ml AGE-HSA作用1h,可有效减少AGE-HSA所致Moesin蛋白磷酸化。p38上游激酶MKK6b结构活性型突变体的重组腺病毒MKK6b(E),在无外来刺激的情况下即可使Moesin磷酸化水平显著增多;且MKK6b的无活性突变体MKK6b(A)可明显抑制AGE-HSA对Moesin磷酸化的作用;p38a亚型的无活性突变体p38a(A)也可显著抑制AGE-HSA对Moesin磷酸化的作用,p38β(A)则无此作用;且p38α(A)与MKK6b(E)共转染,可阻断后者对Moesin磷酸化的作用,而p38β(A)则不可阻断MKK6b(E)的作用。预先加入SB203580(25μmol/L)30min,继以100μg/ml AGE-HSA作用1h,可显著降低AGE-HSA诱导的单层内皮细胞通透性的增高,使Pa值降为122.9±6.2%(P＜0.05)。重组腺病毒无活性型突变体MKK6b(A),p38α(A)预转染内皮细胞24h,可降低AGEs所致的高通透性(P＜0.05)。而p38β(A)则不能阻断AGEs引发的高通透性。(2)在组织水平,预先给予SB203580(10,25μmol/L)可使相对Pa值分别降为195.7±42.4%和163.5±30.7%(P＜0.05)并显示出剂量依赖效应。抑制剂本身对血管通透性无影响。大鼠尾静脉注射重组腺病毒无活性型突变体MKK6b(A),p38α(A)或p38β(A)24 h后,游离皮肤微静脉,插管测基础通透系数并给予50μg/ml AGE-HSA继续灌流1h后再测通透系数。结果显示,MKK6b(A)或p38α(A)均可显著降低AGEs所致的高通透性(P＜0.05),而p38β(A)则无此作用。证明p38通路特别是其α亚型参与介导了AGE-HSA引起的Moesin磷酸化和对内皮细胞功能的影响。8.AGE-HSA作用后引起磷酸化Moesin在细胞内分布的改变在激光共聚焦显微镜下观察,可见在正常内皮细胞中,非磷酸化Moesin主要分布在胞浆区域。而磷酸化的Moesin主要分布在细胞周边,线条完整连续。内皮细胞暴露于50μg/ml AGE-HSA1h后,可见磷酸化的Moesin荧光强度明显增多,且从细胞周边向胞浆内分布,形成非极性单行排列的束状结构;而非磷酸化的Moesin分布无明显变化。用100μg/ml可溶性RAGE抗体(anti-RAGE IgG)预处理细胞1h,可阻断AGE-HSA对磷酸化Moesin蛋白的作用,使细胞周边轮廓清晰。预先加入ROCK抑制剂Y-27632(25μmol/L)或p38 MAPK抑制剂SB203580(25μmol/L),均可有效减少AGE-HSA所致磷酸化Moesin的再分布。p38上游激酶MKK6b结构活性型突变体的重组腺病毒MKK6b(E),在无外来刺激的情况下即可明显诱导磷酸化Moesin的细胞内再分布;且MKK6b和p38α的无活性突变体MKK6b(A)和p38α(A)可明显抑制AGE-HSA对Moesin的作用,而p38β(A)则无此作用。结论:1.AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引血管通透性的增高。2.AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引起磷酸化的Moesin、ERM蛋白表达增多。抑制Moesin蛋白的表达,可显著抑制AGEs诱导的内皮细胞功能障碍,提示AGEs通过使Moesin蛋白磷酸化引起细胞骨架改变,进而导致内皮细胞功能障碍。3.可溶性RAGE的抗体可阻抑AGEs诱导的Moesin磷酸化和血管通透性升高,提示AGE-RAGE的结合在转导信号入细胞的过程中起重要作用。4.ROCK抑制剂可阻抑AGEs引起的Moesin磷酸化及内皮细胞功能障碍,且阻止Moesin的表达并不能影响AGEs所引起的ROCK磷酸化增多,提示Rho激酶参与了这一病理过程,且位于Moesin蛋白的上游。5.p38 MAPK参与了AGEs介导的Moesin磷酸化及内皮细胞功能障碍的信号转导过程,其中p38 MAPK主要通过其α亚型发挥作用。