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倍半萜内酯是植物中广泛存在的一大类次生代谢产物,是很多药用植物的活性成分,具有开发成药物的潜力。倍半萜内酯生物合成途径上基因的挖掘有助于在分子水平解析其合成机制,为在微生物中异源合成提供基因元件。目前倍半萜内酯合成途径上基因的研究甚少。根据碳骨架的不同,倍半萜内酯可分为吉玛烷型、愈创木烷型、苍耳烷型、假愈创木烷型和桉烷型内酯等,菊科植物苍耳(Xanthium strumariumL.)含有丰富的愈创木烷型和苍耳烷型内酯,本研究选取苍耳为实验材料,利用IlluminaHiSeq 2000测序平台建立苍耳不同部位的转录组,为倍半萜内酯合成途径上基因的挖掘提供丰富的信息。基于对苍耳转录组的分析,筛选了一系列倍半萜内酯合成途径上的候选基因,并对关键基因倍半萜合酶基因和CYP450基因进行克隆和功能分析。目前取得的实验结果如下:1苍耳叶片和腺毛转录组测序:利用第二代高通量测序技术-IlluminaHiSeq 2000对两种化学型(湖北型和遵义型)苍耳叶片及湖北型苍耳腺毛细胞进行转录组测序,获得14.2 G数据。157百万clean reads组装得到91,861条unigene,其中59,858条unigene得到功能注释。2苍耳倍半萜内酯合成途径上基因的筛选:通过对苍耳转录组数据的分析,筛选到11条倍半萜合酶候选基因,以及可能参与苍耳倍半萜内酯合成和调控的修饰酶基因和转录因子,包括70条CYP450基因,30条醇脱氢酶基因,20条醛脱氢酶基因,27条乙酰转移酶基因,8条过氧化物水解酶基因,4条氧环化酶基因和116条编码转录因子的基因。3苍耳倍半萜合酶基因的克隆和功能分析:基于转录组的分析,分离克隆了3条倍半萜合酶基因XsTPS1-3。并利用酵母系统和原核表达系统对XsTPS1-3的功能进行分析,结果表明XsTPS1主要生成大根香叶烯D(germacrene D);XsTPS2催化合成guaia-4,6-diene,XsTPS3催化生成大根香叶烯A(germacrene A);利用荧光实时定量PCR和GC-MS分别对苍耳根、茎、叶中XsTPS1-3的基因表达特性和产物积累特性进行了分析,两者基本一致,表明XsTPS1-3参与了植物体内相关倍半萜烯的合成。另外,XsTPS3的基因表达模式与苍耳中倍半萜内酯的积累呈正相关,说明XsTPS3参与苍耳中倍半萜内酯的合成。4苍耳CYP450基因的克隆和功能分析:前人的研究表明大根香叶烯A酸可能是倍半萜内酯形成的共同前体,CYP450催化大根香叶烯A酸分别在C6和C8位形成羟基,进而形成最终的C12-6和C12-8内酯化合物。有趣的是,通过酵母系统,我们筛选到XsCYP3,可高效利用大根香叶烯A酸,但并不是在C6和C8位形成羟基,而是形成了新的产物。基因表达特性分析表明XsCYP3在腺毛中高表达,与倍半萜内酯合成部位一致,可能参与了苍耳倍半萜内酯化合物的合成。XsCYP3的挖掘为倍半萜内酯的合成途径的解析带来新的思路。