野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv. campestris，Xcc)是十字花科植物最严重病害，黑腐病的致病菌，是全世界十字花科作物的主要病害之一。野油菜黄单胞菌也是植物病原细菌致病性遗传学研究的模式菌。近年来，随着Xcc基因组测序的完成，国内外在Xcc致病机理的研究上已取得很大的进展。已报道有包括蛋白酶、果胶酶和纤维素酶等多种胞外酶参与Xcc的病程(pathogenesis)，并对控制胞外酶基因表达的rpf基因簇进行了深入研究。这些胞外酶通过组织浸离，降解植物细胞壁等多种手段最终导致细胞死亡从而帮助致病菌Xcc侵染寄主植物。病原菌胞外酶的运输主要通过II型分泌系统(Type II secretion system简称T2SS)。T2SS在Xcc致病过程中发挥着不可替代的作用。因此对Xcc T2SS相关基因表达调控的研究，对建立黑腐病的防治提供理和技术有重要意义。作者首先用平板酶活法筛选了Xcc8004菌株的Tn5随机插入突变体库，获得6个分泌能力显著降低的突变体。其中包括1个胞外酶engXCA基因缺失突变体、4个II型分泌系统结构基因突变体xpsD，xpsE， xpsF和xpsL、一个转录调控因子clp基因突变体。　　 利用RT-PCR分析clp突变体内胞外酶基因及II型分泌系统结构基因的转录，发现clp基因突变体后，胞外酶eng KCA基因和II型分泌系统结构基因xpsE的转录水平与野生型相比明显降低。对clp和engXCA两个突变体分别进行功能互补，发现相应互补菌株的胞外酶分泌和致病力得到部分恢复。我们又用蛋白银染、蛋白印记等方法分析了筛选到的T2SS结构基因突变体，发现xpsD，xpsE， xpsF和xpsL这四种结构基因突变影响Xcc胞外酶的分泌。　　 作者对clp突变体进行了较详细的研究。首先Northern blotting分析显示clp突变eng KCA基因不再转录。在野生型及却突变体内过量表达clp基因，会使纤维素酶、胞外多糖及XpsE蛋白的合成量显著提高。而xpsE基因启动子GUS(xpsE::GUS)融合检测、RT-PCR及Western blotting分析均显示clp突变影响xpsE基因转录和XpsE蛋白合成。研究Xcc野生型中xpsE基因在不同生长阶段的转录，发现xpsE基因与纤维素酶基因一样也具有生长密度依赖性表达的特点。而且纤维素酶人工底物CMC可诱导xpsE基因的转录。作者分析了engXCA和xpsE基因的上游序列，分别发现了CRP蛋白识别的特异性DNA序列。进一步的体外蛋白-DNA结合实验显示Clp与大肠杆菌同源蛋白CRP相同，能结合到所调控基因上游区域内含有一致性结合位点的DNA片断。不同长度的xpsE探针的凝胶阻滞研究显示xpsE基因上游-114 bp到-253 bp是Clp蛋白结合所必需的。　　 前人研究表明，Clp蛋白作为重要的全局性调控因子同群体感应信号DSF一样参与野油菜黄单胞菌中许多致病相关基因的表达调控。因此，研究Clp蛋白在Xcc复杂的调控网络中所处的位置及其自身的表达调控，对充分了解野油菜黄单胞菌的致病机制非常有意义。作者通过启动子GUS融合表达了解到clp基因在Xcc整个生长阶段都高水平相对稳定的转录，在生长末期，转录水平有提高。rpfF是Xcc重要群体感应信号分子DSF合成所必需的，它编码一个可能的烯脂酰辅酶A水合酶。RpfG是Xcc双组分信号系统的效应调节蛋白。Real-time PCR分析显示rplF和rpfG突变体内clp基因转录水平显著降低。其中rpfF突变体内clp转录水平又明显低于rpfG。Western blotting分析也显示rpfF和rpfG突变体内Clp蛋白的表达明显低于野生型。过量表达clp基因可以部分恢拖拖复rpfG突变体内纤维素酶的合成，同时也能降低黄单胞菌黄色素的合成量。但过量表达clp基因却不能恢复rpfF突变体正常的胞外分泌表型。rpf基因突变影响Xcc在宿主植物甘蓝内的生长繁殖。过量表达clp基因可以部分恢复rpfF突变体的致病力。　　 本论文的研究表明全局性调控因子Clp蛋白在野油菜黄单胞菌致病相关基因的调控中发挥着重要功能，它同时控制着胞外酶engXCA基因和T2SS结构基因xpsE的转录。Clp调控基因表达的方式与其同源蛋白CRP一样，可直接结合到所调控基因的上游序列。Clp对Xcc内基因表达的影响是多方面的，过量表达clp基因可以提高致病因子的合成量，但影响Xcc在宿主内的繁殖。作为重要的调控因子clp基因自身的转录受DSF合成基因rpfF及双组分效应调节蛋白RpfG的调控。Xcc的T2SS结构基因xpsE的表达不是组成型的，具有生长阶段依赖性的特点。另外xpsE除了受Clp的调控外，还受胞外酶人工底物的诱导。