第一部分胚胎干细胞抑制小鼠肝癌的体外研究目的:研究体外胚胎干细胞对小鼠肝癌细胞hepa1-6的抑制能力及相关分子机制。方法:利用Transwell小体共培养胚胎干细胞和hepa1-6肝癌细胞;制备24、48及72小时胚胎干细胞条件培养基培养小鼠肝癌细胞hepa1-6,MTT检测24-144小时肝癌细胞增殖情况。48小时胚胎干细胞条件培养基培养肝癌细胞,流式细胞仪检测肝癌细胞周期变化及凋亡情况。48小时胚胎干细胞条件培养基培养肝癌细胞,west-blotting了解细胞周期调控相关蛋白表达变化情况。结果:1.Transwell小体共培养胚胎干细胞和肝癌细胞72小时起肝癌细胞增殖受抑制,抑制效应持续至实验结束;2.不同时间段胚胎干细胞条件培养期抑制肝癌细胞增殖效能不同,72小时抑制能力最强;3.胚胎干细胞条件培养基对肝癌细胞的抑制同阻滞肝癌细胞于G1期有关,同细胞凋亡无关;4.胚胎干细胞条件培养基调控细胞周期同降低细胞周期G1相关蛋白Cyclin D1/CDK4/CDK6的表达有关。结论:胚胎干细胞体外可通过调控小鼠肝癌细胞细胞周期G1相关cyclinD1-CDK4/CDK6低表达,阻滞肝癌细胞于G1期,进而抑制肝癌细胞增殖。第二部分胚胎干细胞条件培养基抑制肝癌细胞增殖的microRNA调控目的:研究胚胎干细胞微环境抑制肝癌细胞增殖时肝癌细胞miRNAs的变化及可能的调节机制。方法:microRNA基因芯片高通量筛查出在胚胎干细胞条件培养基中增殖抑制的肝癌细胞同对照组正常生长的肝癌细胞microRNA的符合上调或者下调倍数变化值>=2.0且P值<0.05的差异表达;RT-PCR验证差异表达miRNAs;数据库差异筛选miRNAs生物信息学分析。结果:1.芯片高通量筛查出符合上调或者下调倍数变化值>=2.0且P值<0.05差异且经过RT-PCR证实的3个上调miRNAs(mi R-10a-5p、mi R-29b-1-5p及mi R-421-3p),3个下调miRNAs(mi R-1187、mi R-134-5p及mi R-3070b-3p);2.Target Scan、PITA及microRNAorg三个数据库预测差异miRNAs得到423个交集靶基因;3.交集靶基因显著靶向性功能分析富集显示差异miRNAs前20位预测靶基因生物学功能大都同细胞DNA合成、凋亡及信号传导有关,交集靶基因富集显著性信号通路包括癌症信号传导、wnt信号传导、hippo信号传导等肿瘤常见信号通路。结论:miRNAs可能通过调控细胞周期相关m RNAs及wnt信号通路蛋白参与胚胎干细胞条件培养基抑制肝癌细胞增殖。第三部分胚胎干细胞疫苗抑制小鼠肝癌的体内实验目的:了解胚胎干细胞疫苗及不同疫苗接种方式对低及高瘤负荷小鼠肝癌的治疗作用。方法:制备胚胎干细胞疫苗及hepa1-6肝癌细胞皮下移植瘤小鼠模型,低瘤负荷肝癌模型为肝癌细胞同胚胎干细胞疫苗同时接种,疫苗分为瘤体内接种及皮下接种;高瘤负荷肝癌模型为皮下移植瘤可触及后接种疫苗,观察瘤体生长情况,ELISA法检测免疫相关细胞因子及流式细胞仪检测免疫相关指标。结果:1.胚胎干细胞疫苗可有效抑制低瘤负荷肝癌小鼠肿瘤生长,疫苗接种组无瘤率(疫苗瘤内组100%、疫苗皮下组90%)同对照组存在统计学差异(p<0.001);2.IL-2、INF-γ疫苗接种2组均同对照组存在统计学差异,外周血CD4+T、CD8+T细胞疫苗接种2组同对照组均存在统计学差异,CD19+B细胞、脾脏Treg细胞及IL-10仅疫苗瘤内接种同对照组有统计学差异3.胚胎干细胞疫苗对高瘤负荷小鼠肝癌无治疗作用,两组在肿瘤生长速度及实验结束时肿瘤体积均未见统计学差异,且疫苗接种组肿瘤组织内Treg较对照组增加,有统计学差异(p=0.0054)。结论:胚胎干细胞疫苗可免疫治疗小鼠低瘤负荷状态肝癌,但疫苗瘤内注射无法激活有效免疫效应治疗高瘤负荷阶段肝癌。