本论文由4部分内容组成。（1）大鼠短间隔连续部分肝切除中再生肝上调表达基因的克隆与分析；（2）短间隔连续部分肝切除cDNA文库构建；（3）短间隔连续部分肝切除中再生肝特异表达全长cDNA的克隆；（4）短间隔连续部分肝切除模型中肝再生的不同时相与细胞凋亡有关的蛋白检测。 肝脏是哺乳动物体中唯一能再生的器官。1931年Higgins和Anderson建立的一次性大鼠大部分肝切除提供了研究肝再生的理想模型，这一模型已在研究哺乳动物组织和器官重建、细胞增殖、分化与去分化、生理生化调控等方面得到了十分广泛的应用。但由于肝再生的复杂性使得人们对肝再生的分子机理迄今了解尚少，为了更好的分析肝再生的分子机理，徐存拴等首次以一次性肝切除后4h（细胞进入去分化期）和36h（细胞分裂高峰）建立了短间隔连续部分肝切除模型（short interval successive partial hepatectomy,SISPH），该模型以两个肝再生的关键时点为标准来研究肝再生的分子机理，已受到国内外同行的广泛关注和认可。 本研究以徐存拴等建立的短间隔连续部分肝切除0-4-40-76-112h为实验模 描州大学2皿2年傅士早业论人 大民沤间而汪滇邢艾肝勺卜历再生申上们现这基困的兄陆与功讹方析 型，应用抑制性消减杂交技术，cDNA文库构建技术，Southern杂交和蛋白质印 迹技术与方法，探讨了正常对照和 SISPH实验材料中差异表达的ESTs，全长基 因及SISPH各时相周期蛋白和凋亡蛋白的表达，为研究肝再生分子机理提供了 新的思路和依据。 材料与方法： 采用 SISPH模型，以假手术为对照，以 SISPH 112h为处理，用抑制性消减 杂交技术（SUppreSSIOll Sllbtf8CtiVe hybndiZati。fi，SSH）研究了 SISpH 模型中差异 表达的基因；以SISPH 112h为实验材料，应用RT－PCR 限制性酶切消化，蛋 白酶消化，蛋白包装等方法构建了 SISPH 12h。DNA文库；以 SSH文库中的 ESTS 为探针，借助于Southern杂交技术克隆了全长。DNA基因；以SISPH中的 0A叶0刁64 为实验材料，借助于hstern blot技术对各切除时点细胞周期蛋白 和凋亡蛋白进行了检测。 结果： l、克隆了 9个同源性为 100％EST，44个同源性不等的 ESTs，其中一个与 Genbarik无任何同源性的全新EST，这些上调表达的ESTs序列中，主要包括以 下几类： 门)与正性、负性急性反应因子或蛋白有关的基因。如血清淀粉样因子A、 转铁蛋白、触珠蛋白、a－酸性糖蛋白、纤维蛋白原等，推测这些基因 的上调表达与肝再生有密切关系； （2）与线粒体氧化磷酸化有关的基因。如大鼠锚蛋白结合蛋白、线粒体细胞 色素氧化酶亚单位1、11、Ill等的上调表达可能是由于SISPH造成肝 局部缺氧而使线粒体功能性代偿增生，也表明肝再生过程对能量有更多 的需求；NADH：ubiqulnone的上调表达表明依赖于 NADH（苹果酸＋ 谷氨酸）的能量供应途径在肝再生中的作用更大； （3）与蛋白质合成有关的基因。与小鼠线粒体核糖酶蛋白基因有95％同源性 EST的发现为满足肝再生需要而大量合成iNA，另外核糖体蛋白LS 的表达水平在肝再生中也升高可能为了满足细胞增殖对蛋白质的要求； （4）与细胞分裂相关的基因。如微管结合蛋白合成上调，它不仅是信号传导 中的一个靶物，而且是细胞周期调节的一个重要5！擎分子CdC－2激酶的。 2 邓州大学2002卓俗士早业论文 大肌厄月隔工人功方肝切阶肝再生申上们表这篡因的丑巨与功止分析 靶物：微管结合蛋白还参与细胞有丝分裂中细胞骨架的形成，在细胞增 殖中起关键作用： （5）与信号传导相关的基因。如精氨酸酶，它可能参与NO信号通路，共同 调节肝再生的信号传导； （6）其它基因。如 T－激肽原，FK506，GABA等。 2、从SISPH 112h CDNA文库中克隆出了 9个 CDNA全长基因，它们在肝再生 中的可能作用是： 门)LRI基因（GenBank accession No．AF479660）与大鼠甲状腺素结合蛋白 基因有73．7％的同源性，肝组织中甲状腺素转运蛋白的上调表达意义有 二：（1）打破了肝再生刺激因子与抑制因子的平衡作用，使肝细胞去 分化增强；（2）影响酶的诱导与氧