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目的:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染呈全球性分布,感染人数超过1.7亿,我国也是丙型肝炎病毒感染流行高发区,我国HCV感染率为1.5～3.5%,感染人群3000万以上。感染后约80%成为慢性持续状态,演变为慢性肝炎,肝硬化,并与原发性肝癌的发生关系密切。HCV引起的肝脏疾病在不断增加,由此阐明HCV及其它可能辅助因子对丙型肝炎有关的肝脏疾病的进展的影响相当重要。目前亦有许多研究证明铁对慢性HCV感染的肝脏病变的进展有重要作用。HCVNS5A是功能非常活跃的HCV非结构蛋白,它在干扰素疗效预测、病毒复制、抗病毒抗性、肝细胞癌发生等方面均具有重要作用,Hepcidin(hepatic bactericidal protein)是最近发现的一种由肝脏分泌的小分子抗菌肽,是调节机体铁稳态过程中起核心作用的铁调节激素。HCVNS5A可使肝细胞产生过氧化物,使肝细胞处于氧化应激状态,细胞内ROS水平增加。由于ROS可以通过调节细胞内多种信号途径下调或抑制hepcidin基因的表达,那么我们推测HCVNS5A诱导的ROS同样可下调或抑制hepcidin基因的表达。本研究利用细胞转染技术瞬时和稳定转染HCV NS5A表达质粒(pcNS5A),再用间接免疫荧光的方法检测转染是否成功,在通过RT-PCR的检测方法探讨HCV NS5A对hepcidin基因的影响,并进一步探讨其可能机制。方法:1.HCV NS5A表达质粒的酶切鉴定:采用双酶切的方法将pcNS5A进行酶切,产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离。2.质粒转染:1)瞬时转染:转染前,在35mm培养皿上种植5×10~5 QSG7701细胞,按美国生物技术公司提供的脂质体Lipofectin2000转染程序,将pcNS5A、pRc/CMV质粒导入细胞,24小时后换10%的胎牛血清培养基,72小时后收获。2)稳定转染:同样转染前在35mm培养皿上种植5×10~5QSG7701细胞,按美国生物技术公司提供的脂质体Lipofectin2000转染程序,将pcNS5A、pRc/CMV导入细胞,24小时后换加入含合适浓度G418(200ug/ml)的10%的胎牛血清培养基进行筛选,4周左右出现细胞克隆,再行单克隆筛选,并用同样浓度的含G418的10%的胎牛血清培养基维持培养。3.添加LPS:同样按上述方法将pcNS5A、pRc/CMV质粒瞬时转染至QSG7701细胞,48小时后,根据文献LPS按200ug/ml加入细胞培养基,24小时后收获细胞。4.间接免疫荧光:用间接免疫荧光的方法,检测HCVNS5A蛋白的表达,鉴定转染是否成功。5.RT-PCR:按照RNA提取试剂盒提取转染细胞的总RNA,取10μgRNA,用MMLV逆转录成cDNA,再进行PCR扩增,2%的琼脂糖凝胶电泳观察结果。结果:1.pcNS5A进行酶切后获得预期大小的HCV NS5A酶切片段。2.转染pcNS5A质粒细胞内有HCV NS5A蛋白的表达,呈现绿色荧光颗粒,分布在细胞浆中。未转染组和转染pRc/CMV组细胞内没有HCV NS5A蛋白的表达。3.利用基因转染技术,分别将转染pcNS5A、pRc/CMV和未转染组用RT-PCR检测hepcidin mRNA的表达.转染pcNS5A组hepcidin mRNA表达低于转染pRc/CMV和未转染组,且稳定转染组较瞬时转染组hepcidin mRNA的表达下降更明显,而转染pRc/CMV和未转染组hepcidin mRNA表达相似,说明pRc/CMV空载体对hepcidin mRNA的表达无影响,HCV NS5A减弱hepcidin mRNA的表达。4.利用基因转染技术,将转染pcNS5A瞬时转染至QSG7701细胞,再加入LPS,用RT-PCR的方法检测各组细胞中hepcidinmRNA的表达。结果显示LPS+空白组hepcidin mRNA的表达高于其它各组,LPS+转染pcNS5A组hepcidin mRNA的表达低于LPS+空白组,又较空白组和转染pcNS5A组高,说明LPS可增强hepcidin mRNA的表达,且HCV NS5A可减弱其增强效应。结论:1.HCV NS5A表达质粒成功转染至QSG7701细胞中,表达HCV NS5A蛋白。2.HCV NS5A抑制hepcidin mRNA的表达。3.LPS可增强hepcidin的表达,HCV NS5A可减弱其增强效应。