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研究背景和目的：转移是肿瘤患者致死的最主要原因,但是对肿瘤转移机制的了解相对较少。上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程,参与动物胚胎早期发育中多种组织和器官的形成。近年来的研究发现EMT与肿瘤的发生发展和转移耐药密切相关。化疗是肿瘤治疗的主要手段之一。部分肿瘤细胞能在自身和药物双重作用下获得转移和耐药的新性状,从而导致化疗失败。本课题以人胃癌细胞BGC-823为对象,研究化疗药物阿霉素诱导的EMT效应并探讨其机制,以期为肿瘤的治疗提供新的思路。研究内容和方法：阿霉素短期处理BGC-823细胞,显微镜下观察细胞形态的变化、免疫荧光和RT-PCR技术检测EMT相关分子的表达水平、Transwell和划痕-愈合实验检测细胞的迁移能力,从形态、分子和功能等三个不同方面证实阿霉素能诱导EMT。利用Western blot和RT-PCR检测阿霉素诱导前后β-catenin信号途径相关分子的表达水平。分别利用β-catenin的选择性抑制剂吲哚美辛和β-catenin的特异性siRNA联合阿霉素作用于BGC-823细胞,观察β-catenin抑制后对阿霉素诱导的EMT及细胞迁移能力的影响。收集阿霉素处理后的药物存活细胞并进行连续传代培养,RT-qPCR和Western blot检测EMT相关分子的表达,RT-qPCR检测染色质重编程因子Oct4、Sox2、Klf4和c-myc的表达,验证阿霉素诱导的EMT具有表观遗传学的特征。利用特异性siRNA干扰组蛋白乙酰基转移酶p300的表达后,Western blot检测EMT相关分子的表达水平,证实长期培养的药物存活细胞中EMT的维持依赖于p300。软琼脂克隆形成实验检测长期培养的药物存活细胞的克隆形成能力,MTT实验检测细胞对阿霉素的耐受能力。研究结果：阿霉素处理BGC-823细胞48小时后,可使细胞形态从鹅卵石形转变为梭形,细胞间距增加,细胞排列变得不规则。免疫荧光、Western blot和RT-PCR实验表明药物存活细胞(drug survival cell, DSC)高表达间质细胞特征分子Vimentn、 Twist,并且低表达上皮细胞特征分子E-cadherin。 Transwell和划痕-愈合实验均表明药物存活细胞的迁移能力增加。这些结果证明阿霉素处理能诱导BGC-823细胞发生EMT。 BGC-823细胞经阿霉素处理后β-catenin的表达水平上升,Lefl和c-myc的转录水平增强,表明β-catenin信号途径被激活。吲哚美辛或者β-catenin特异性的siRNA均能抑制阿霉素诱导的EMT及肿瘤细胞的迁移,说明β-catenin在阿霉素诱导的EMT中发挥重要作用。同时发现吲哚美辛联合阿霉素作用于BGC-823细胞后导致β-catenin的表达水平下调,且对阿霉素呈浓度依赖性。但是吲哚美辛单独作用于BGC-823能引起β-catenin表达的上调,提示吲哚美辛需要在其它因子(例如PPAR-γ)的协同下才能发挥抑制β-catenin的作用。在将阿霉素处理48小时后的细胞继续培养时,只有少部分细胞能存活并形成克隆。收集并进行传代培养后发现,这些长期培养的药物存活细胞(long term cultured DSC, ltDSC)仍具有间质细胞的形态特征,并且高表达Vimentin、 Twist和β-catenin,低表达E-cadherin,提示仍具有EMT的特征。软琼脂克隆形成实验表明ltDSC具有较亲本细胞更强的克隆形成能力。MTT实验表明ltDSC对阿霉素的耐受能力增强。RT-qPCR证实ltDSC中高表达染色质重编程因子Oct4和c-myc。 Western blot证实ltDSC中高表达组蛋白乙酰基转移酶p300。利用特异性siRNA干扰p300的表达后,ltDSC的EMT特征消失,提示组蛋白乙酰化可能在EMT的维持中起着重要作用。研究结论和意义：本课题发现阿霉素处理能诱导BGC-823细胞发生EMT,使肿瘤细胞的转移能力增强。阿霉素诱导的EMT受到β-catenin信号途径的调控。阿霉素处理后得到的ltDSC具有较亲本细胞更强的克隆形成能力和药物耐受能力,高表达染色质重编程因子。ltDSC仍能维持EMT的表型,且依赖于组蛋白乙酰基转移酶p300,表明表观遗传学机制在其中起着重要作用。本研究为克服肿瘤化疗中的转移和药物耐受现象提供了新的思路。