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研究目的水蛭防治心脑血管疾病的疗效显著,以水蛭为原料药的中成药逐渐增多。蚂蟥Whitmania pigra Whitman作为水蛭的主要来源之一,用量也越来越大。野生蚂蟥资源匮乏,人工养殖蚂蟥的出现解决了这一燃眉之急。但蚂蟥养殖环境的污染问题日益严重,致使蚂蟥体内铅(Pb)含量超标,严重影响水蛭药材的安全性与有效性。本课题旨在揭示铅污染对水蛭代谢及其抗凝血作用的影响,从代谢水平探究其影响机制,为保障水蛭药材的安全性与有效性提供理论基础。研究方法1.铅污染水蛭的养殖及其代谢组学研究:利用硝酸铅对养殖土壤进行不同浓度污染(高、中、低污染组),在水族箱内模仿蚂蟥养殖环境对其进行为期50天的饲养,以获得被铅污染的水蛭药材。2.铅污染水蛭对凝血功能和血液流变的影响:(1)利用全自动凝血分析仪测定加入不同处理组水蛭提取液的兔血浆的APTT值和PT值,研究铅污染水蛭在体外对血浆凝血功能的影响。(2)使用皮下注射肾上腺素加冰水浴的方法建立大鼠急性血瘀模型,然后提取不同处理组水蛭药材,灌胃给药血瘀模型大鼠,通过采集大鼠血液进行凝血功能和血液流变学检测,研究铅污染对水蛭干预血瘀大鼠血液流变与凝血功能的影响。(3)利用全自动凝血分析仪测定空白大鼠和给药PbNO3大鼠的凝血功能,研究铅自身对大鼠凝血功能的影响。3.利用UPLC-Q/TOF-MS测定来自不同铅污染环境的水蛭组织样品,通过比较各组代谢物的差异,探究铅污染对水蛭的影响。4.基于代谢组学研究铅污染对水蛭抗凝血作用的影响:利用UPLC-Orbitrap-MS测定不同处理组SD大鼠的血浆,通过比较各组大鼠血浆代谢物的差异,探究铅污染对水蛭干预血瘀大鼠的影响。实验结果1.成功获得不同处理组水蛭样品:空白组(铅残留量:2.05 mg.kg-1);铅低残留组(铅残留量:3.185 mg·kg-1);铅中残留组(6.46 mg·kg-1);铅高残留组(10.66 mg·kg-1)。2.不同处理组水蛭提取液对兔血浆APTT值和PT值影响的结果显示:与生理盐水组相比,水蛭提取液在体外能显著(P<0.05)延长兔血浆的APTT值;但是加入铅污染水蛭提取液的兔血浆的APTT值均比加入空白水蛭提取液的低,其中铅高残留组的APTT值与空白水蛭组存在显著性差异(P<0.05);不同处理组水蛭提取液在体外对兔血浆的PT值无明显影响。利用全自动凝血分析仪测定各组大鼠的凝血功能的结果显示:血瘀模型组的APTT、PT和TT值均比空白对照组低,而FIB值较空白对照组高,其中PT值和FIB值在统计学上存在显著性差异(P<0.05)。无污染水蛭组和空白水蛭组的APTT值无显著性差异,而铅污染水蛭组与水蛭组的APTT值存在显著性差异。血瘀模型组与铅污染水蛭组的FIB值无显著性差异,无污染水蛭组与铅污染水蛭组的FIB值存在显著性差异。利用全自动血液流变测试仪测定各组大鼠的血液流变情况,结果显示:血瘀模型组和空白对照组的WBV200、WBV30和WBV3在统计学上存在显著性差异(P<0.05);无污染水蛭组和空白对照组的WBV200、WBV30、WBV3和PV无显著性差异;铅污染水蛭组的WBV200、WBV30、WBV3和PV与血瘀模型在统计学上无显著性差异;无污染水蛭组与铅污染水蛭组的WBV200和WBV30存在显著性差异(P<0.05)。利用全自动凝血分析仪测定空白大鼠和给药Pb大鼠的凝血功能,结果显示空白大鼠和给药Pb大鼠的APTT、PT、TT以及FIB值均无显著性差异。3.水蛭组织代谢组学研究结果显示:空白水蛭组和铅污染水蛭组样本点完全分开,而且分开趋势呈剂量依赖性变化。总共寻找到24种差异代谢物,其中13种差异代谢物在铅低、中、高残留组中的变化存在剂量依赖性。代谢物大致分为磷脂、甘油三酸酯、核苷酸、二肽等类别,主要涉及能量代谢、脂质代谢、核酸代谢,蛋白质分解等。4.利用代谢组学技术检测各组大鼠血浆,并对各组大鼠血浆样本数据进行模式识别分析,结果显示:空白对照组和血瘀模型组样本点完全分开,无污染水蛭组和与血瘀模型组分离,有向空白组靠近的趋势;铅污染水蛭组与血瘀模型组样本点混合在一起,无法分离。在血浆样本中筛选出与血瘀证相关的差异代谢物25个,主要涉及苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸的生物合成,苯丙氨酸代谢,花生四烯酸代谢,组氨酸代谢等代谢通路。采用水蛭干预后,一半以上的代谢物表现出向对照组回调的趋势,而铅污染水蛭组没有出现上述回调趋势。结论水蛭能通过增强凝血功能、改善血液流动不畅发挥抗凝血作用。与之相反,铅污染水蛭即不能增强凝血功能,也不能改善血液流动性,因而无法发挥抗凝血作用。铅自身不会对大鼠的凝血功能产生影响。水蛭组织代谢物与其抗凝血作用密切相关。铅污染会导致水蛭的脂质过氧化、基因损伤和蛋白质分解,水蛭的自我保护作用是促进细胞膜的修复和DNA及RNA的修复,并激活抗氧化剂水平。水蛭通过调节血瘀证大鼠的花生四烯酸代谢、苯丙氨酸的合成与代谢、组氨酸代谢、谷氨酰胺代谢等代谢途径,改善血瘀证大鼠的能量代谢、增强其免疫力,产生抗炎作用,缓解和治疗血瘀证。与之相反,铅污染水蛭不能调节上述代谢物与代谢通路,无法缓解及治疗血瘀证。创新点首次利用代谢组学研究铅污染对水蛭组织代谢物的影响。首次利用代谢组学研究铅污染对水蛭干预血瘀大鼠的影响。