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目的:研究表明昼夜节律与代谢性疾病密切相关。本研究旨在观察链脲佐菌素(STZ)诱导的Ⅰ型糖尿病小鼠角膜时钟基因、分裂细胞和炎症细胞随昼夜节律的变化,以及胰岛素对糖尿病小鼠角膜节律的影响。并探索通过药理性手段干预时钟基因来促进糖尿病角膜创伤修复的可能性。 方法: 1.糖尿病小鼠模型 模型组小鼠空腹12h后一次性腹腔注射STZ(150mg/kg),采用断尾取血法,使用血糖仪检测造模后的小鼠血糖,非禁食状态血糖值≥11.1mmol/L为造模成功。STZ给药3d后,STZ小鼠早晚注射胰岛素,连续注射11d。 2.免疫荧光染色 利用整铺片技术,DAPI染色显示角膜分裂细胞(细胞核成对存在),anti-Ly6g抗体染色显示角膜缘血管网募集的嗜中性粒细胞,anti-GL3抗体染色显示迁移到角膜的γδT细胞。 3.糖尿病小鼠角膜创伤修复模型的建立 糖尿病造模成功后,糖尿病小鼠注射3mg/kg的SR8278。每天给药一次,注射7天。其他组小鼠注射等体积的含有相同浓度 DMSO的PBS。注射 SR8278第7天后,进行角膜创伤修复模型的建立。使用直径为2 mm的环钻标记角膜中央区域,高尔夫样刀机械性刮伤角膜上皮细胞层。创伤后不同时间点使用2%的荧光素钠染色分别显示正常小鼠、糖尿病小鼠(STZ)、STZ+SR8278小鼠的创伤面积。 4.实时荧光定量PCR 使用实时荧光定量PCR技术检测小鼠角膜组织中Clock、Bmal1、Per2、Cry1、Rev-erb?和Sirt1基因的相对表达量。 结果: 1.胰岛素部分恢复糖尿病小鼠角膜昼夜节律的改变 (1)糖尿病小鼠角膜组织的Clock、Bmal1、Per2、Cry1和Rev-erb?基因表达的昼夜节律发生了改变,其中Clock、Bmal1和Per2的表达降低,而Cry1和Rev-erb?的表达增高。使用胰岛素后,Cry1、Per2和 Rev-erb?基因昼夜节律部分恢复,而Clock和Bmal1的节律没有恢复。 (2)糖尿病小鼠角膜上皮有丝分裂细胞的昼夜节律发生了改变,糖尿病小鼠组分裂细胞数目比正常组小鼠显著性下降。胰岛素部分恢复糖尿病小鼠角膜有丝分裂细胞的昼夜节律。 (3)糖尿病小鼠角膜缘血管网募集的嗜中性粒细胞和γδT细胞的昼夜节律发生了改变,且嗜中性粒细胞和γδT细胞数目比正常组显著增高。胰岛素部分恢复糖尿病小鼠嗜中性粒细胞和γδT细胞的昼夜节律。 2.Rev-erb?拮抗剂SR8278加速糖尿病小鼠角膜创伤修复 (1)荧光素钠染色结果显示,正常组小鼠角膜在创伤后24h完成再上皮化,STZ小鼠在创伤后42h完成再上皮化,STZ+SR8278小鼠在创伤后30h完成再上皮化。(2)角膜创伤后上皮分裂细胞的动力学变化结果显示,正常组小鼠在创伤后30h达到峰值,而STZ小鼠在36h达到峰值,STZ+SR8278在24h达到峰值。 (3)角膜创伤后迁移到角膜中央的嗜中性粒细胞的动力学变化结果显示,正常组小鼠的嗜中性粒细胞在创伤后18h达到峰值,而STZ小鼠在12h即达到峰值,且维持到30h,STZ+SR8278小鼠角膜中央嗜中性粒细胞募集数目在创伤后18h达到峰值。 (4)小鼠角膜Bmal1基因与Sirt1基因的变化结果显示,STZ组小鼠角膜的Bmal1基因与正常组小鼠相比显著降低,注射SR8278后,STZ+SR8278组小鼠的Bmal1基因与 STZ组和 Normal组小鼠相比显著升高。STZ组小鼠与正常组小鼠相比Sirt1基因的表达显著降低,STZ+SR8278组小鼠与正常组和STZ组相比均显著增加。 (5)SR8278对糖尿病小鼠生理指标结果显示,SR8278不能降低糖尿病小鼠的血糖;也没有降低糖尿病小鼠的尿量;STZ小鼠活动度比正常组小鼠降低。STZ+SR8278小鼠的活动度比STZ小鼠增高,但仍低于正常组小鼠。 结论:糖尿病小鼠角膜分子水平(Clock、Bmal1、Per2、Cry1和Rev-erbα)和细胞水平(上皮细胞有丝分裂、嗜中性粒细胞和γδT细胞)的昼夜节律发生了改变。外源性胰岛素可部分恢复糖尿病小鼠角膜的上述昼夜节律相关的改变。Rev-erb?拮抗剂SR8278可能通过增强Sirt1基因的表达加速糖尿病小鼠角膜的创伤修复。