目的：生长因子作为刺激创面细胞由静止状态发生增殖和迁移的触发者,在创面愈合中发挥着至关重要的作用。皮肤是一个复杂的器官,为了维持和协调皮肤的正常状态,其内部存在着一系列复杂的细胞与细胞,细胞与因子,因子与因子间的相互作用机制。在创伤的愈合过程中,多种生长因子被证实在创面的修复中发挥了重要作用。角质细胞生长因子(KGF)是成纤维细胞生长因子家族的第七个成员,因此也被称为成纤维细胞生长因子-7(FGF-7)。KGF作为一种旁分泌的生长因子,由各种间质细胞所分泌,包括成纤维细胞,内皮细胞,平滑肌细胞,以及树突状表皮T细胞等。KGF通过表皮细胞上的特异受体FGFR2-IIIb而发挥作用。KGF由间质细胞分泌,却作用于表皮细胞。在小鼠和人的创伤形成后,KGF的表达上升160倍。细胞学试验表明,KGF能特定地促进角质细胞的增殖与迁移。KGF刺激角质细胞DNA合成的能力比TGF-α和EGF强2-10倍。同时,有研究表明将KGF外用于创面能有效的促进创面的再上皮化。这些研究角质都表明了KGF在创面愈合中发挥的作用。因此,本实验室通过基因敲除获得KGF基因缺失的小鼠,并对这种小鼠的生长发育和表型进行观察。同时,我们通过在KGF基因敲除的小鼠背部建立全层创面模型,来研究KGF在创面愈合的作用及其与皮肤其它细胞和因子的相互作用。另一方面,随着全球糖尿病发病率及患病率迅速增长,糖尿病的并发症,如视网膜病变、糖尿病性肾病、神经病变和创面难愈等对患者极大的威胁。糖尿病患者皮肤很容易受损,创面愈合的能力严重降低,往往反复发作,迁延不愈,形成顽固难愈性创面,导致感染,最终致残。糖尿病难愈创面的修复成为临床上面临的巨大难题。糖尿病小鼠在创面愈合过程中表现出炎症反应时间延长,创面血管化受损,以及胶原合成减少。各种生长因子的表达也出现异常。然而,有些生长因子却能逆转糖尿病小鼠创面的愈合延迟,比如血小板源性生长因子(PDGF)以及成纤维细胞生长因子家族。因此在本试验中,我们采用KGF基因敲除的小鼠和野生型小鼠来研究KGF在全层创面愈合的作用及其与皮肤其它细胞和因子的相互作用。同时,通过杂交获得KGF敲除的糖尿病小鼠,并建立创面模型,探讨KGF在糖尿病创面中的作用。方法：1.KGF的基因,包括三个外显子(extron)和两个内含子(intron).在KGF的三个外显子中,一号外显子的作用被认为是其中最不可替代的一个。因此,本实验室的Guo等利用胚胎干细胞技术,通过破坏一号外显子达到敲除KGF的目的,获得了KGF基因敲除的小鼠。KGF基因敲除小鼠为研究其功能提供了重要工具。同时,为了探讨KGF基因在糖尿病小鼠中的作用,我们通过杂交的方式,获得了种KGF基因敲除的糖尿病小鼠。通过KGF基因敲除小鼠和杂交的KGF基因敲除的糖尿病小鼠来作为探讨KGF对小鼠创面愈合作用的基础。为了得到KGF敲除的糖尿病小鼠我们采用雄性KGF敲除的小鼠(KGF-/-Lepr+/+)和杂合子的雌性基因型糖尿病小鼠(KGF+/+Leprdb/+)来进行杂交获得种畜,将其中含Leprdb/+基因的小鼠选出来,将含有该基因的公鼠与母鼠杂交。利用southern杂交和PCR对他们的后代进行基因型鉴定,根据其不同的基因型而分成四组：KGF敲除的糖尿病小鼠组(Exp.,KGF-/-Leprdb/db),糖尿病小鼠组(Db/db,KGF+/+Leprdb/db), KGF敲除小鼠组(KGF null, KGF-/-Lepr+/+)和野生型小鼠组(WT, KGF+/+Lepr+/+),并对这四组小鼠进行观察。2.在KGF基因敲除小鼠(KGF null,n=12)和野生型小鼠(WT,n=12)背面建立全层创面模型。采用测量面积的方法计算创面创面开放率,创面收缩率,创面再上皮化率。在伤后第七天,两组小鼠各随机安乐死处死6只,一半组织用于免疫组化染色HE染色观察创面上皮化情况,Ki-67染色观察创面基底角质细胞的有丝分裂,CD-31染色观察创面血管化情况；另一半用于实时PCR检测Ⅰ型胶原(Col-I),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),转换生长因子-β1(TGF-β1),碱性成纤维生长因子(bFGF),表皮生长因子(EGF),胰岛素样生长因子-1(IGF-1)以及血管内皮生长因子(VEGF)的表达。3.在KGF基因敲除糖尿病小鼠(Exp.,n=8)和基因型糖尿病小鼠(Db/db,n=8)背面建立全层创面模型。采用测量面积的方法计算创面创面开放率,创面收缩率创面再上皮化率。在伤后第七天,两组小鼠各随机安乐死处死4只,一半组织用于免疫组化染色HE染色观察创面上皮化情况, Ki-67染色观察创面基底角质细胞的有丝分裂,CD-31染色观察创面血管化情况；另一半用于实时PCR检测Col-I,α-SMA,TGF-p1, bFGF,EGF,IGF-1和VEGF的表达。基因敲除小鼠毛囊排列更为紊乱。KGF基因敲除的糖尿病小鼠与糖尿病小鼠的体重明显重于KGF基因敲除小鼠和野生型小鼠。并且,KGF基因敲除的糖尿病小鼠体重稍微轻于糖尿病小鼠。KGF基因敲除的糖尿病小鼠既有糖尿病小鼠肥胖的表现型,同时也表现出KGF基因敲除小鼠的凌乱和油腻的皮毛外观。2.KGF基因敲除小鼠与野生型小鼠创面愈合没有显著差别,KGF的缺失对创面开放率,创面收缩率,创面再上皮化率均未造成影响。KGF敲除组创面角质细胞增值率明显下降,上皮组织迁移和面积的测量结果显示KGF基因敲除组创面的上皮化略低于野生组,但两组之间不存在统计学差异。KGF敲除组的血管密度明显低于野生组。在伤后第7天,创面组织中Col-Ⅰ,α-SMA, TGF-β1, bFGF, EGF, IGF-1在两组中的表达没有差别。VEGF在KGF敲除组中的表达却明显降低。3.KGF基因敲除糖尿病小鼠创面愈合明显慢于对照组,KGF的缺失对创面开放率,创面再上皮化率均未造成影响,但使创面收缩率下降。两组创面基底角质细胞增值率,上皮化以及血管密度无明显差别。在伤后第7天,创面组织中Col-Ⅰ,α-SMA,TGF-β1, bFGF, EGF, IGF-1和VEGF在两组中的表达没有差别。结论：1.KGF基因敲除影响了小鼠毛囊的发育从而造成其皮毛外观的改变。杂交获得的KGF基因敲除的糖尿病小鼠既有糖尿病小鼠肥胖的表现型,同时也表现出KGF基因敲除小鼠的凌乱和油腻的皮毛外观。2.正常小鼠KGF基因敲除并未影响创面愈合,KGF的缺失使角质细胞增值率明显下降,但创面仍能正常上皮化。KGF的缺失使创面血管化程度和VEGF的表达明显降低,说明KGF对创面血管化和VEGF的表达起调节作用。3.糖尿病小鼠KGF基因敲除通过降低创面收缩影响了创面愈合。