烧烫伤是生活中常见的意外伤害。目前,临床上多采用包扎疗法处理烧烫伤创面。包扎疗法中所用的创面敷料作为创面的临时覆盖物,在创面愈合过程中,它可以临时替代皮肤起到保护作用,防止创面感染发炎,为创面愈合提供一个有利的环境。创面敷料根据敷料形式可以分为薄膜型敷料、水凝胶型敷料、喷雾型敷料和海绵型敷料。其中,海绵型敷料具有比较大的孔隙率,能够吸收较多创面渗出液,并且具有较好的透气性，不会造成创面渗出液的积聚。针对深Ⅱ度烫伤创面渗出液较多的特点,本课题选用海绵型敷料进行研究。创面敷料的常用材料有胶原、壳聚糖、透明质酸、海藻酸盐等,本课题选择生物大分子-胶原和壳聚糖为基材,并复合肝素研制海绵型敷料用于深Ⅱ度烧烫伤的创面愈合。临床研究证实肝素(Heparin)具有治疗烧烫伤的作用。肝素促进创面修复的作用机制如下：肝素能够改善创面微循环,有效防止血栓形成；还可以保护并协同机体在创伤局部分泌的表皮生长因子(EGF),成纤维细胞生长因子(FGF)发挥促愈合的作用；肝素还可以影响胶原重建,肝素和胶原酶形成复合物,调控胶原纤维的重新排列,使胶原纤维排列更加整齐,使创面逐渐上皮化。虽然有肝素用于烧烫伤治疗临床实践,但其应用并未普及。因为肝素注射给药后在体内的半衰期较短,需要频繁给药,而肝素全身高剂量给药易发生出血,所以临床上使用肝素治疗烧烫伤以局部用药的方式更佳。胶原(Collagen)是皮肤的主要成分。胶原作为生物大分子,具有良好的生物相容性、生物可降解性和弱抗原性,所以胶原在生物医学材料和药物缓释领域中有着广泛的应用。但是单一组分的胶原海绵机械强度较低,并且易降解,所以一般加入交联剂或氨基聚糖增加胶原海绵的机械强度,调节胶原海绵的降解性。壳聚糖(Chitosan)是一种重要的组织工程生物材料,具有良好的生物相容性、抗菌活性、生物可降解性,被制作成人工皮肤和可降解手术缝合线等。大量研究证明，壳聚糖对细菌和真菌都具有抑制作用。尤其是对一些创面常见的细菌,如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢杆菌的生长都具有明显的抑菌作用。本研究针对渗出液多的深Ⅱ度感染创伤,设计了肝素化胶原/壳聚糖海绵。以胶原和壳聚糖这两种材料为基材,使用EDC/NHS交联剂复合肝素,制成了胶原和壳聚糖配比一定(w/w,2：8),二者的质量总百分含量不同的肝素化胶原／壳聚糖海绵,并对总百分含量不同的海绵的理化性质,包括表观密度、孔隙率、吸水性、保湿性、溶失率等进行了系统研究,筛选出理化性质较优海绵配方。通过测定抑菌圈的大小对筛选出的海绵的体外抑菌活性进行了评价,并对筛选出的海绵主要生物相容性进行了评价。包括体外细胞毒性、急性全身毒性和溶血率。在此基础上,利用大鼠全皮肤切层模型和豚鼠深Ⅱ度烫伤感染模型,对制备的肝素化胶原/壳聚糖海绵进行了抗感染、促愈合作用及机制考察。本研究主要取得以下研究成果：1.猪皮Ⅰ型胶原的制备及结构确证。采用酸膨胀-胃蛋白酶降解法从猪皮中提取胶原,以Sigma Ⅰ型胶原标准品为对照品,通过紫外光谱扫描、红外光谱扫描、SDS-PAGE凝胶电泳以及羟脯氨酸含量测定等结构确证实验,证实提取的胶原为Ⅰ型胶原。2.胶原和壳聚糖总百分含量不同的肝素化胶原/壳聚糖海绵的制备及理化性质研究。采取步冻干法制备肝素化胶原/壳聚糖海绵,首先制备胶原和壳聚糖配比一定(w/w,2：8),二者的总质量百分含量不同(1.2%、2.4%和3.0%)的胶原／壳聚糖海绵；然后用EDC/NHS交联剂复合肝素后再次冻干获得肝素化胶原／壳聚糖海绵。评价了胶原和壳聚糖总百分含量不同的海绵的理化性质,包括表观密度、孔隙率、吸水率、保湿性、透气率以及溶失率等,筛选出理化性质较为优越的合适百分含量的海绵做进一步研究。同时测定了胶原和壳聚糖总百分含量为2.4%的肝素化胶原/壳聚糖海绵(2.4% C-C-H海绵)中肝素的体外释放曲线,证实了海绵敷料中的肝素能够缓慢释放,不存在突释现象。3.所研制海绵敷料的体外抑菌作用评价。选择大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢杆菌这三种创面易感染的细菌为研究对象,评价了自制海绵敷料体外抑菌作用。证实自制海绵敷料对这三种细菌均具有明显的抑菌作用,而商品胶原海绵没有抑菌作用。4.所研制海绵敷料的生物安全性考察。评价了胶原和壳聚糖总百分含量为2.4%的交联胶原/壳聚糖海绵(2.4% C-C海绵)、2.4% C-C-H海绵和商品胶原海绵的部分生物相容牲,包括体外细胞毒性、急性全身毒性和溶血率。结果表明自24%C-C和2.4%C-C-H海绵具有好的生物安全性。5.肝素化胶原／壳聚糖海绵对大鼠全皮肤缺损创面愈合的影响。在大鼠全皮肤切层模型造模14天时,拍照记录创面轮廓,并利用Image J软件计算创面愈合率,然后取皮肤组织进行HE染色和VEGE,EGF的免疫组化检测。结果表明,纱布组、商品胶原海绵组、2.4% C-C海绵组和2.4% C-C-H海绵组的创面愈合率分别为85.5%、99.8%、98.3%和90.1%。HE结果表明,愈合效果最好的2.4% C-C海绵组,其次是商品胶原海绵组、2.4% C-C-H海绵组、纱布组。术后14天时VEGE和EGF的免疫组化结果表明,VEGF在各组创面组织中都有所表达,其中2.4% C-C-H海绵组为强阳性(+++),商品胶原海绵组和2.4% C-C海绵组为中度阳性(++),纱布组为弱阳性(+)。EGF在各组的创面组织中均有表达,商品胶原海绵组、2.4% C-C海绵组和2.4% C-C-H海绵组的创面组织中EGF的量差别不明显,均为中度阳性,纱布组为弱阳性。虽然在创面愈合后期2.4% C-C-H海绵组的创面组织中VEGF和EGF的量比其他三组略多,该海绵能够促进创面愈合,但是在创面愈合初期该海绵中的肝素会抑制血小板的聚集和释放,并且肝素具有抗炎活性,这两方面的作用会延迟创面愈合。所以在术后14天时,2.4%C-C-H海绵组中的大鼠创面愈合率略低于2.4% C-C海绵组中的大鼠创面愈合率。显示在全皮肤缺损创面愈合中,2.4% C-C海绵效果更优。6.肝素化胶原/壳聚糖海绵对豚鼠深度烧伤感染模型创面愈合的影响。分别于术后4、7天时,拍照记录创面轮廓,并利用Image J软件计算创面愈合率,并取皮肤组织进行HE和疫组化检测。结果表明,术后4天,纱布组、商品胶原海绵组、2.4% C-C海绵组和2.4% C-C-H海绵组的创面愈合率分别为19.0%、23.6%、31.0%和34.0%。术后7天,纱布组、商品胶原海绵组、2.4% C-C海绵组和2.4% C-C-H海绵组的创面愈合率分别为36.9%、 39.5%、41.2%和57.0%。HE染色结果表明,纱布组、商品胶原海绵组创面有大量的脓细胞和炎细胞,而2.4% C-C海绵组和2.4% C-C-H海绵组创面只有少量的脓细胞和炎细胞。愈合效果最好的2.4% C-C-H海绵组,其次是2.4% C-C海绵组、商品胶原海绵组、纱布组。术后4天时,VEGE和EGF的免疫组化结果表明,VEGF在各组创面组织中都有所表达,其中2.4% C-C-H海绵组为中度阳性(+++),其他三组为弱阳性(+)。EGF在纱布组(-)的创面组织中没有表达,而在其他三组的创面组织中均有所表达。并且EGF在2.4% C-C-H海绵组(+++)的创面组织中的量高于2.4%C-C海绵组(++)和商品胶原海绵组(++)。这表明,2.4% C-C-H海绵组对于豚鼠深Ⅱ度烧伤感染模型有抗感染、促愈合的作用。总之,本课题研制的肝素化胶原/壳聚糖海绵具有良好的理化性质和生物相安全溶性,显著的抗菌活性,通过大鼠全皮肤切层模型和豚鼠深Ⅱ度烫伤感染模型,初步证实了肝素化胶原/壳聚糖海绵具有抗感染和促进创面愈合的作用。但是,还需要进一步从安全性和促进创面愈合的有效性和作用机制方面继续深入开展研究工作,以使其尽快走向临床。