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研究背景嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)免疫细胞治疗是一种创新治疗肿瘤的疗法,该疗法在临床上已表现出对部分B细胞恶性血液瘤有良好的治愈效果。CAR-T细胞主要是通过一段人工合成的可特异识别肿瘤相关抗原(Tumor Associated Antigen,TAA)的单链可变区片段(Single Chain Variable Fragment,sc Fv)与TAA结合而使T细胞活化,进而发挥抗肿瘤效应。这种表达CAR分子的T细胞的激活摆脱了固有的主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)限制性。将近年来,人们不断对CAR-T细胞治疗肿瘤的疗法进行优化,以期得到更好的治疗效果。其中发现CAR-T细胞表达免疫检查点抑制剂的疗法在治疗血液瘤或实体瘤中疗效显著。但这大部分研究中均使用病毒作为载体来制备自分泌免疫检查点抑制剂的CAR-T细胞,极少使用非病毒载体。本实验中证明,使用piggy Bac转座子系统制备自分泌抗程序性死亡蛋白1(Programmed Cell Death Protein 1,PD1)抗体的CAR-T细胞对肿瘤同样具有良好的治疗效果,但使用PB转座子(piggybac transposon,PB)整合系统时,CAR-T细胞自分泌抗体量水平往往较低,极可能导致疗效未发挥到最佳。因此,目前还需要找到一种能够提高T细胞表达外源基因的方法,以期解决现存的这一难题。研究目的本研究旨在构建并筛选出高活性且T细胞表达特异性的嵌合启动子,随后构建最优启动子驱动外源抗PD1抗体基因载体,并将其与间皮素(mesothelin,MSLN)CAR共转染至T淋巴细胞中;探究优化后启动子对CAR-T细胞各项功能的影响,如在体外和体内分泌抗PD1抗体的功能以及对高表达PDL1/MSLN肿瘤细胞株的杀伤能力。以期优化后启动子能够提高基于PB转座子整合系统的自分泌抗PD1抗体的CAR-T细胞对肿瘤细胞的治疗效果。研究方法1.应用实时细胞分析(Real-Time Cell Analysis,RTCA)的实验方法验证pS338B-αPD1/CAR-T细胞的抗肿瘤活性,并用酶联免疫吸附试验(EnzymeLinked Immuno Sorbent Assay,ELISA)检测其抗体表达水平;2.腺病毒感染法构建PDL1高表达人卵巢癌细胞株SKOV3,筛选后流式细胞术检测SKOV3细胞表面PDL1受体表达水平;3.应用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)等分子生物实验技术构建一系列携带EGFP或Fluc报告基因的嵌合细胞因子启动子质粒,将构建好的携带报告基因的嵌合细胞因子启动子质粒电转染至T淋巴细胞中,通过流式细胞术定性的或双荧光素酶报告系统定量的检测嵌合细胞因子启动子的活性,从中筛选出活性最高的嵌合启动子组合;4.使用PCR等分子生物实验技术构建表达外源基因抗PD1抗体的表达载体pS-CIFT-αPD1以及MSLN CAR质粒,并利用电转染法将两种质粒共转染至人T淋巴细胞,流式细胞术检测MSLN CAR在T细胞表面的表达效率,ELISA检测CAR-T细胞分泌抗PD1抗体的潜能;5.通过流式细胞术检测CAR-T细胞中央记忆T细胞(Central memory T cell,TCM)、效应记忆T细胞(Effector memory T cell,TEM)及耗竭表型(PD1)的表达水平;6.设置不同效靶比(T细胞:肿瘤细胞)1:2/1:4/1:8/1:16,使用流式细胞术评价体外CAR-T细胞的杀伤能力,使用ELISA检测表达特异性抗原的肿瘤细胞刺激时CAR-T分泌干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)和PD1抗体的能力;7.选择NSG雌性小鼠并构建SKOV3-PDL1肿瘤移植模型,成瘤后分组给予未转染的T细胞(control T)、含原启动子CAR-T组(pS338B-αPD1/CAR-T)或改造筛选后启动子(pS-CIFT-αPD1/CAR-T)尾静脉输注治疗,并检测三组T细胞输注对卵巢癌皮下移植瘤生长进展的影响;8.T细胞治疗期间,每周取小鼠静脉血,分离小鼠外周血单个核细胞,进行CD3抗体染色,流式细胞术分析评估T细胞在小鼠外周血中生存情况。分离血清,ELISA检测其中抗体,CBA染色后用流式细胞术检测细胞因子表达情况。研究结果1.成功构建表达PDL1的人卵巢癌细胞,且细胞表面PDL1表达率约为99.99%。2.成功使用原实验室保存质粒制备MSLN特异性的CAR-T细胞CAR-T以及自分泌抗PD1抗体的CAR-T细胞pS338B-αPD1/CAR-T,经体外实验证实,pS338B-αPD1/CAR-T细胞抗肿瘤能力以及抗PD1抗体分泌能力优于CAR-T组。但使用PB转座子整合系统时,抗PD1抗体分泌量过低,远未达到临床药用剂量。3.成功构建并筛选出高活性的含IFN-γ启动子核心区的嵌合启动子组合CIFT(CMV增强子+IFN-γ核心启动子+TLTR序列),并发现该组合型启动子活性在IFN-γ高表达的细胞中更高且在PBMC中特异性表达。4.成功制备了分泌抗PD1抗体的MSLN特异性的CAR-T细胞,pS338B-αPD1/CAR-T和pS-CIFT-αPD1/CAR-T,两组CAR表达效率高于60%;在体外使用MSLN抗原刺激发现pS-CIFT-αPD1/CAR-T组IFN-γ和抗PD1抗体分泌量均高于pS338B-αPD1/CAR-T组,无抗原刺激时,两组细胞因子及抗体分泌量趋势大致一样,说明pS-CIFT-αPD1/CAR-T细胞分泌抗PD1抗体潜能更易受抗原刺激影响。5.体外监测自分泌抗体CAR-T细胞表型变化,发现CAR-T细胞自分泌抗体能够有效结合T细胞PD1分子,且pS-CIFT-αPD1/CAR-T细胞TCM表达更持久。6.pS-CIFT-αPD1/CAR-T细胞可特异性杀伤高表达PDL1/MSLN的肿瘤细胞SKOV3-PDL1且较pS338B-αPD1/CAR-T组杀伤作用更强,随着效靶比的升高分泌PD1抗体和IFN-γ水平上升;两组自分泌PD1抗体的CAR-T细胞对低表达PDL1的SKOV3肿瘤细胞杀伤效果无明显差别。7.成功构建人卵巢癌小鼠皮下移植瘤模型,相较于对照组(control T)细胞治疗,自分泌PD1抗体的CAR-T(pS338B-αPD1/CAR-T和pS-CIFT-αPD1/CART)细胞治疗明显抑制了肿瘤的生长,延长小鼠存活。8.荷瘤小鼠输注T细胞治疗后,在小鼠外周血中成功检测到输注的pS-CIFT-αPD1/CAR-T细胞的存活,但未检测到control T或pS338B-αPD1/CAR-T细胞;同时在小鼠血清中检测到pS-CIFT-αPD1/CAR-T细胞分泌高水平抗PD1抗体。研究结论1.自分泌抗PD1抗体的MSLN CAR-T细胞在体外能特异性识别杀伤PDL1/MSLN阳性的肿瘤细胞。2.优化组合启动子CIFT(CMV增强子+IFN-γ核心启动子+TLTR序列)能够有效提高CAR-T细胞自分泌抗PD1抗体的能力及其对抗原刺激敏感。并且CART细胞分泌抗PD1抗体的产量与抗原刺激T细胞活化状态有关,降低了抗体过量表达的风险。3.pS-CIFT-αPD1/CAR-T细胞静脉输注到小鼠体内后可有效增殖、分泌高水平的抗PD1抗体以及有效抑制卵巢癌SKOV3-PDL1皮下移植瘤的生长进展,提高小鼠生存期。4.使用CIFT启动子,CAR-T细胞能够更高效、更安全的表达外源基因或蛋白,为优化CAR-T细胞免疫疗法提供了新的思路和理论基础。