动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病、心绞痛、心肌梗死、脑梗死的发病基础,由AS引发的心脑血管病已成为我国主要死亡原因之一。AS发生机制十分复杂,包括内皮功能损伤、凝血功能障碍、脂质代谢紊乱等一系列病理生理学改变。近年来大量研究表明,AS的发生与氧化应激、炎症反应、脂蛋白滞留等密切相关,病理学改变主要为内皮损伤后单核细胞黏附与聚积、脂质颗粒沉积、泡沫细胞形成、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖及向内膜下迁移,最终导致内膜增生和斑块形成。活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)过量产生所引起的氧化应激(oxidative stress)在AS的发生发展过程中发挥重要作用。研究证明,高脂血症时,各种滞留在血液中的脂蛋白可被ROS过氧化修饰。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)为血浆中富含胆固醇的低密度脂蛋白(LDL),是目前已知的AS危险因子。ox-LDL能促进VSMCs增殖外,还能与血管活性因子和生长因子协同作用,对AS的发生发展起重要作用。炎症反应(inflammation)也在AS的发生和发展过程中起着重要作用。近年研究证明,细胞内氧化应激信号可选择性诱导炎症相关基因的表达,氧化应激与炎症反应相互作用、相互影响,形成连锁反应,共同导致AS的发生与发展。同时,ox-LDL作用于血管内皮细胞后,使其释放出大量趋化因子和黏附因子,促进白细胞的游走和黏附,从而加重炎症反应和血管内皮的损伤。中医络病理论认为,AS与络脉瘀阻、络气瘀滞有关。目前对于AS的治疗多以他汀类药物为主联合中成药,采用中西医结合方式。中西药联合应用一方面可降低西药的副作用,另一方面可增加疗效,减少药量。通络方药的代表方剂通心络(Tongxinluo,TXL)是我国的传统中药,已用于临床二十多年,是人参、赤芍、酸枣仁、檀香、降香、土鳖虫、蜈蚣、水蛭、蝉蜕、全蝎、乳香及冰片等十二味中药的复方提取物。该方剂的理法方药及治疗原则为化瘀通络、流气畅络、搜风通络。现代医学研究认为,通络干预能改善心肌缺血、降低血脂、稳定动脉粥样硬化斑块、预防心肌梗死,虽经多年研究,但因TXL成分复杂,作用靶点多,目前对抗AS的作用机制仍未阐明。本研究采用apo E-/-小鼠(apo E-deficient mice)和人心脏微血管内皮细胞(human cardiac microvascular endothelial cells,HCMECs)从整体水平和细胞水平上研究TXL抗AS与抑制氧化应激和炎症反应的关系。第一部分通心络抑制apo E-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的形成目的:观察通心络apo E-/-小鼠动脉粥样硬化斑形成的抑制作用。方法:1 C57BL/6小鼠和apo E-/-小鼠分别给予正常饮食和高脂饮食12周,高脂组小鼠分别给予生理盐水、通心络和阿托伐他汀灌胃12周。2采用超声和解剖镜检查斑块面积。3取小鼠血清测定血脂水平。4应用苏木精-伊红染色和油红染色对小鼠主动脉弓冰冻切片染色,进一步评价斑块大小。5免疫组化法检查小鼠血管内皮细胞CD31的表达。1通心络抑制动脉粥样硬化斑块的形成apo E-/-小鼠给予高脂饮食12周,并分别给予生理盐水、通心络和阿托伐他汀灌胃,超声检查显示,通心络和阿托伐他汀组小鼠升主动脉及血管分支处斑块减少,解剖镜检查结果与B超结果一致。同时,应用苏木精-伊红染色和油红染色对小鼠主动脉弓冰冻切片染色发现,通心络和阿托伐他汀组管腔内斑块面积明显减小,且两组间无明显差异。以上结果说明,通心络可显著抑制动脉硬化斑块的形成。2通心络可显著降低小鼠血脂水平取小鼠血清经全自动生化分析仪测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)。结果显示,高脂组与对照组相比,TC、TG、LDL明显升高,通心络组和阿托伐他汀组三者均明显降低,其中,阿托伐他汀组降脂作用更明显。在给药前后,对照组与药物干预组小鼠体重比较无明显变化。3通心络通过保护血管内皮细胞抑制动脉粥样硬化斑块的形成主动脉弓冰冻切片经CD31免疫组化染色显示,高脂组CD31表达较对照组减少,通心络和阿托伐他汀组CD31表达增加,提示通心络可能通过保护内皮细胞来抑制动脉粥样硬化的发展。小结:通心络通过降低血脂水平及保护血管内皮细胞而抑制动脉粥样硬化斑块的形成。第二部分通心络抑制血管内皮细胞氧化应激反应目的:观察通络干预对C16诱导的血管内皮细胞氧化应激的影响。方法:1用C16诱发人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)的氧化应激反应,同时用不同浓度通心络进行干预。2 DHE染色检测各组HCMEC的ROS水平。3用相应诊断试剂盒分别检测细胞培养液中MDA、NO、SOD的水平。4 q RT-PCR检测HCMEC和小鼠主动脉弓组织中HO-1、p22phox、p47phox的m RNA表达水平。5 Western blot检测HCMEC中HO-1、p22phox、p47phox的蛋白表达水平。6免疫组织化学法检测小鼠主动脉弓组织中HO-1、p22phox、p47phox的蛋白表达水平。1通心络抑制C16诱导的HCMEC中ROS的生成DHE染色结果显示,与对照组相比,C16处理使HCMEC中的ROS生成显著增多,说明C16可以引起HCMEC氧自由基的生成。通心络干预组的ROS水平比C16处理组明显下降,说明通心络对C16诱导的HCMEC中ROS的生成有明显的抑制作用。通心络对未受C16刺激的HCMEC的ROS水平无影响。这一结果提示,通心络可以减轻血管内皮细胞的氧化应激。2在C16诱导的HCMEC,通心络能减少MDA的生成,促进NO合成,拮抗C16对SOD的抑制对HCMEC培养液中MDA、NO、SOD检测的结果显示,与对照组相比,C16处理使HCMEC培养基中的MDA含量显著增加,而通心络干预组的MDA含量比C16处理组明显下降,并呈浓度依赖性。同时,C16处理还使HCMEC培养基中NO含量和SOD活性显著下降,而通心络干预组以浓度依赖性的方式使NO的生成显著增加,SOD活性也高于C16处理组。这些结果说明,通心络通过诱导SOD表达而降低脂质过氧化,从而减轻氧化应激对HCMEC的损伤。3通心络抑制C16诱导的HCMEC中NADPH氧化酶和HO-1的表达q RT-PCR结果显示,与对照组相比,C16处理使HCMEC中NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox以及HO-1的m RNA表达水平显著上升,而通心络干预明显抑制p22phox、p47phox以及HO-1的m RNA表达水平并呈浓度依赖性。同时,Western blot结果显示,C16处理的HCMEC中p22phox、p47phox以及HO-1的蛋白表达水平显著高于对照组,而通心络干预明显抑制了p22phox、p47phox以及HO-1的蛋白表达。以上结果说明,通心络减轻血管内皮细胞氧化应激反应可能与抑制NADPH氧化酶的表达有关。4通心络抑制动脉粥样硬化小鼠血管中NADPH氧化酶和HO-1的表达为进一步观察通心络在活体水平上对NADPH氧化酶和HO-1表达的影响,对小鼠主动脉弓进行免疫组化检测。结果显示,与对照组小鼠相比,高脂饮食的apo E-/-小鼠主动脉弓组织中NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox以及HO-1的蛋白表达明显上调,而给予通心络灌胃的高脂饮食apo E-/-小鼠主动脉弓组织中p22phox、p47phox以及HO-1的蛋白表达显著下降。同时,提取各组小鼠主动脉弓组织总m RNA进行q RT-PCR检测,结果显示,动脉粥样硬化小鼠主动脉弓组织中p22phox、p47phox以及HO-1的m RNA表达水平明显高于对照组小鼠,而通心络处理的小鼠p22phox、p47phox以及HO-1的m RNA表达水平显著下降,与阿托伐他汀灌胃组无差别。以上结果进一步说明,通心络抗动脉粥样硬化的作用可能与抑制NADPH氧化酶亚基的表达有关。小结:通心络通过抑制NADPH氧化酶亚基p22phox和p47phox表达而减少活性氧自由基的产生,通过上调SOD表达,增加活性氧自由基的清除,减少脂质过氧化,在多个环节上抑制氧化应激反应。第三部分通心络抑制血管炎症反应的作用和机制目的:观察通络干预对血管炎症反应的影响并探讨其作用机制。方法:1用不同浓度C16处理HCMEC,同时用不同浓度通心络进行干预。2 ELISA检测细胞培养液中TNF-α和IL-1β的含量。3 q RT-PCR检测HCMEC和小鼠主动脉弓组织中NF-κB和e NOS的m RNA表达水平。4 Western blot检测HCMEC中NF-κB、e NOS蛋白表达水平以及p22phox、p47phox、NF-κB的磷酸化水平。结果：1通心络干预抑制C16诱导的HCMEC炎性细胞因子的表达与释放对HCMEC培养基进行ELISA检测的结果显示,与对照组相比,C16处理HCMEC以浓度依赖性的方式使HCMEC中TNF-α、IL-1β的分泌量显著增加,说明C16可以诱导血管内皮细胞炎症反应。通心络干预组HCMEC分泌的TNF-α、IL-1β比C16处理组明显减少并呈浓度依赖性,说明通心络可以抑制C16诱导的血管内皮细胞合成与释放炎性因子。2通心络干预抑制HCMEC和小鼠动脉粥样硬化血管中NF-κB和e NOS表达q RT-PCR结果显示,与对照组相比,C16处理使HCMEC中NF-κB m RNA表达水平显著升高,e NOS的m RNA表达水平显著下降。给予通心络干预后,HCMEC中NF-κB m RNA表达水平比C16处理组明显下降,而e NOS的m RNA表达水平比C16处理组明显升高,并且通心络的干预作用都呈剂量依赖性。同时,Western blot结果显示,各组HCMEC中NF-κB和e NOS的蛋白表达变化趋势与m RNA相一致。为进一步观察通心络在活体水平上对NF-κB和e NOS的影响,对从各组小鼠主动脉弓提取的RNA进行q RT-PCR检测,结果显示,与对照组相比,高脂组小鼠主动脉弓组织中NF-κB的m RNA表达明显上调,而通心络灌胃组小鼠的NF-κB m RNA表达显著下降,其NF-κB m RNA水平与阿托伐他汀灌胃组无差别。免疫组化检测e NOS表达的结果显示,与对照组相比,高脂组小鼠主动脉弓组织中e NOS的表达明显减少,而通心络灌胃组小鼠的e NOS表达显著上调。以上结果说明,通心络可以通过下调NF-κB的表达减轻血管炎症反应,同时通过上调e NOS表达改善血管内皮功能。3通心络干预抑制C16诱导的NF-κB和p47 phox激活Western blot结果显示,与对照组相比,C16处理HCMEC使p22phox、p47phox和NF-κB的磷酸化水平显著升高,说明C16激活了NADPH氧化酶系统和NF-κB信号通路。在通心络干预的HCMEC中,p47phox和NF-κB的磷酸化水平比C16处理组明显下降,但对p22phox的磷酸化无影响,说明通心络可以抑制NADPH氧化酶系统中p47phox的激活和NF-κB信号通路。小结:通心络能够抑制炎性细胞因子的合成与释放,其作用机制与抑制p47phox和NF-κB信号通路的激活有关。第四部分mi R-155在动脉粥样硬化发生发展中的作用目的:观察mi R-155缺失对动脉粥样硬化发生发展的影响。方法:1收集冠心病患者血液,用q RT-PCR方法检测血液中mi R-155的水平。2应用苏木精-伊红染色和油红染色对小鼠主动脉弓冰冻切片进行染色,评价斑块大小。3免疫荧光检测小鼠主动脉弓组织中Mac-2和KLF5的表达水平和共定位情况。结果：1冠心病患者血清中mi R-155的含量及其与冠心病危险因素的相关性分析q RT-PCR结果显示,与正常人相比,冠心病患者血液中mi R-155的水平明显下降。经多因素Logistic回归分析发现,血清中mi R-155水平与总胆固醇、糖尿病等心血管危险因素呈明显负相关,而与高血压、吸烟等危险因素无关。2 mi R-155缺失抑制小鼠动脉粥样硬化斑块的形成油红染色结果显示,与apo E-/-小鼠相比,mi R-155-/-apo E-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块显著减少,同时mi R-155-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块少于apo E和mi R-155基因双敲除小鼠,说明mi R-155缺失抑制了小鼠动脉粥样硬化斑块的形成。苏木精-伊红染色的结果显示,apo E-/-小鼠血管内膜增生及斑块形成明显,而mi R-155-/-apo E-/-小鼠血管内膜增生和斑块均不明显,同时mi R-155-/-小鼠几乎观察不到血管内膜增生和斑块。这些结果进一步说明mi R-155缺失可以抑制血管内膜增生及斑块的形成。3 mi R-155缺失抑制巨噬细胞浸润和KLF5表达为了揭示mi R-155在动脉粥样硬化发生发展中的作用,对高脂饮食小鼠主动脉弓进行免疫荧光检测,结果显示,apo E-/-小鼠血管内膜中有大量巨噬细胞浸润并伴有KLF5表达增加,而mi R-155-/-apo E-/-小鼠血管内膜中巨噬细胞浸润较少,同时巨噬细胞表达KLF5减少,mi R-155-/-小鼠浸润到血管壁中的巨噬细胞数量和KLF5表达水平与mi R-155-/-apo E-/-小鼠近似。这些结果说明,mi R-155缺失可以抑制巨噬细胞向血管壁中的浸润,减少KLF5在巨噬细胞中的表达,这可能是mi R-155参与血管内膜增生及动脉粥样硬化斑块形成的机制之一。小结:冠心病患者血液中mi R-155的水平明显低于健康对照者,其与总胆固醇、糖尿病等心血管危险因素呈负相关;mi R-155缺失可以抑制血管内膜增生和动脉粥样硬化斑块的形成,其作用机制可能与抑制巨噬细胞浸润以及减少KLF5在巨噬细胞中的表达有关。结果：1通心络通过降低血脂水平及保护血管内皮细胞而抑制动脉粥样硬化斑块的形成。2通心络通过抑制NADPH氧化酶亚基p22phox和p47phox表达而减少活性氧自由基的产生,通过上调SOD表达,增加活性氧自由基的清除,减少脂质过氧化,在多个环节上抑制氧化应激反应。3通心络能够抑制炎性细胞因子的合成与释放,其作用机制与抑制p47phox和NF-κB信号通路的激活有关。4冠心病患者血液中mi R-155的水平明显低于健康对照者,其与总胆固醇、糖尿病等心血管危险因素呈负相关。5 mi R-155缺失可以抑制血管内膜增生和动脉粥样硬化斑块的形成,其作用机制可能与抑制巨噬细胞浸润以及减少KLF5在巨噬细胞中的表达有关。