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目的：缺血性心脏病(IHD)常并发心肌缺血和坏死，常规治疗缺血性心脏病的手段如冠状动脉腔内介入治疗和冠状动脉旁路手术仅对内径2mm以上心外膜血管病变的治疗效果较佳，而解决2mm以下血管及心肌灌注血管病变相当困难。基因治疗虽然能够促进血管新生，但存在安全性问题。骨骼肌成肌细胞虽然能够改善心脏功能，但不能和心肌细胞形成缝隙连接，可诱发心律失常。内皮前体细胞(EPC)在维持血管功能和促进成体血管新生等方面起着关键作用，能够直接参与血管新生，体外培养可以诱导成为心肌细胞。脂肪干细胞(ADSC)具有多向分化潜能，不仅能够分化成内皮细胞，还能转化为心肌细胞，因此有可能使心肌灌注和心肌再生同时得以解决。本研究探讨体外培养的EPCs自体移植后能否有效促进血管新生，并是否可以分化为心肌细胞：ADSCs体外是否可以转化为心肌细胞和内皮细胞，进行自体移植后能否在心肌梗死区存活并形成心肌细胞，同时促进血管新生，达到改善心脏功能的目的。 方法：(1)EPC促进心肌血管新生研究。抽取动物髂骨骨髓，percoll离心获取单个核细胞(MNCs)，IMDM培养，48小时后收集未贴壁细胞，采用内皮细胞专用培养基培养扩增，分别采用碳化氢荧光染料(DiI)标记的乙酰化低密度脂蛋白(acLDL)，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的Ⅰ型荆豆凝集素(UEA Ⅰ)和鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体对不同代次的细胞进行鉴定。达到细胞移植数量后进行自体移植，结扎动物冠状动脉前降支后2小时后，静脉注射体外培养扩增的EPCs或对照剂磷酸盐缓冲液(PBS)，其中3只动物的EPCs用5-溴2-脱氧尿苷(BrdU)标记。饲养5周，行超声心动图、左心室压力曲线和心肌梗死面积检测，博士研究生毕业论文成体干细胞自体移植治疗缺血性心脏病研究 取心脏行血管密度检测、免疫组织化学检测和组织病理学检查。(2)ADSC体外转 化成心肌细胞和内皮细胞研究。取雄性新西兰白兔腹部皮下脂肪组织，胰蛋白酶 消化，将获取的ADSCS以IMDM培养扩增。分别采用5一氮胞普和内皮细胞专用培 养基诱导ADSC。同时，取大鼠骨髓，获取MNCs，工MDM培养，5一氮胞营诱导，观 察ADSC和MSC两种细胞在转化为心肌细胞方面的差别。分别以抗Q一横纹肌肌动 蛋白(ASA)，肌纤维蛋白和心肌肌钙蛋白T(CTNT)单克隆抗体作为第一抗体， 检测5一氮胞昔诱导后的ADSCs和MSCs是否转化为心肌细胞。以Di工一acLDL、 FITC一UEA和抗VIII因子相关抗原单克隆抗体检测内皮专用培养基培养的ADSCs是否 转化为内皮细胞。(3) ADSC治疗心肌梗死研究。将雄性新西兰白兔分成四组，制 作心肌梗死模型成功后饲养2周，再次手术，分别心肌注射PBS(对照组)、单个 核细胞(MNC组)、未诱导的 ADSC(N ASC组)和诱导后的ADSC(工ASC组)。饲养 5周，行超声心动图、左心室压力曲线和心肌梗死面积检测，取心脏行血管密度 检测，免疫组织化学检测和和组织病理学检查，并追踪移植细胞能否在梗死心肌 组织存活并转化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等。 结果:(1)原代EPCS呈集落状生长，传代后大都均匀分布生长，使用Di工一acLDL 和FITC一UEAI检测阳性，细胞纯度几达100%。第2代EPCs以抗VIII因子相关抗原 单克隆抗体检测阴性，第3代弱阳性，第4一5代阳性。与对照组比较，EPCs移植 5周后，心脏功能明显改善。超声心动图检测显示，治疗组动物Tei指数(T工， 0.81士0.39 vs 0.26士0.13，P<0.01)和左心室射血分数〔LVEF，(38.71士6.62)% vs(53.46士7.84)%，P<0.01]均显著改善。左心室压力曲线检测显示治疗组动 物左心室舒张末压(LVEDP)明显低于对照组(l .96士7.56vs一4.67士6.52 InlllHg， P<0.05)，而+dp/dtmax显著升高(1197.27士361.20 vs 1944.17士916.47 minHg/S，P<0 .05)。组织学检测示心肌梗死面积显著减小〔(巧.09士2 .29)%vs (4.72士2.92)%，P<0.01〕，EPC移植组动物心肌梗死呈点状或点片状，而对照组 动物梗死呈片状，心肌组织未见炎症和血管瘤等。免疫学检测示血管密度明显增加，每高倍(x400)视野血管数目分别为7.2士4.0和37.6士10.6(P<0.01)，标 记细胞主要位于缺血心肌组织，并整合至血管壁中，并且发现，部分EPCs转化 为心肌细胞表型。(2) ADSC接种后生长迅速，呈短梭形，基本不形成集落，生长 迅速，细胞形态单一，呈梭形。5一氮胞营诱导后细胞相互融合，细胞高密度区最 早于第9天形成球形细胞，低密度区细胞诱导后形成网状交叉的多核细胞，免疫竺垫竺生兰些逐一一一一一一止竺坚竺丝竺些鸯缤尹血鞭烹脏病研容.细胞化学检测显示这两种形态的细胞均表达心肌细胞相关抗原。而大鼠骨髓MSCS原代生长非常缓慢，原代绝大部分细胞呈集落生长，细胞形态差别较大，传代细胞分布比较均匀，同源性较好，细胞容易分化和老化。诱导后大鼠MSCs有两种细胞形态改变，一种细胞融合后形成条形或棒状，另一种形成球形，免疫细胞化学鉴定显示