论文部分内容阅读
目的:下肢缺血性疾病的发病率近年来居高不下,病情严重时会导致患者截肢,且目前无有效疗法。研究报道人脐带间充质干细胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,UMSCs）来源的外泌体（Exosomes,Exo）可以促进小鼠缺血后肢的修复,但机制尚未完全阐明。前期研究发现环状RNA（Circular RNA,CircRNA）circDB在UMSC-Exo中富集,并且在小鼠缺血后肢中低表达。本研究旨在阐明UMSC-Exo通过递送circDB在下肢缺血修复中的作用和机制。方法:选取8-12周龄的C57BL/6J雄鼠作为研究对象,随机分为三组,通过手术结扎的方式阻断小鼠左肢股动脉及其所有分支的血流,建立后肢缺血模型。体内,在腓肠肌原位注射等量的磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline,PBS）、外泌体（Exo）或敲低circDB的外泌体（si-circDB）。用血流仪、抓力测量仪和跑步机对小鼠缺血后肢的血流量、抓力和肌肉耐力指标进行检测,用Western Blot和qRT-PCR检测去泛素化酶USP7（Ubiquitin-Specific Protease 7）和细胞增殖因子Notch1（Neurogenic Locus Notch Homolog Protein 1）的表达量。体外,用低氧无血清的方法诱导小鼠成肌细胞损伤模型,分别与等量的PBS、Exo或si-circDB共孵育,用EdU实验检测细胞增殖情况,用Western Blot和qRT-PCR检测USP7和Notch1的表达量,用免疫共沉淀检测USP7和Notch1之间的互作关系,用siRNA技术鉴别信号通路中上下游分子。结果:Western Blot和qRT-PCR结果显示,当小鼠后肢缺血发生后,泛素化程度增强,并且伴随着circDB、USP7和Notch1表达下调。体内实验证明,与si-circDB处理组相比,Exo处理组小鼠后肢的血流、抓力和肌肉耐力恢复得更好。体外实验表明,circDB通过促进USP7和Notch1的表达促进了小鼠成肌细胞增殖。生物信息学预测miR-34a和USP7是circDB的下游靶基因,当敲降小鼠成肌细胞中circDB后,miR-34a表达显著上调。circDB通过抑制miR-34a上调USP7的表达,而USP7作为去泛素化酶稳定了 Notch1的蛋白水平。siRNA技术鉴别出信号通路是circDB/miR-34a/USP7/Notch1。重要的是,UMSC-Exo 可递送 circDB,靶向结合miR-34a,增强USP7表达,进而提高细胞增殖因子Notch1的蛋白质水平,从而促进了小鼠缺血后肢的修复。结论:本研究证明人脐带间充质干细胞来源的外泌体（UMSC-Exo）可以通过递送circDB促进小鼠缺血后肢的血流、抓力和肌肉耐力恢复。UMSC-Exo中的circDB作为miR-34a的分子海绵,促进去泛素化酶USP7的表达,调节Notch1的蛋白质水平,进而达到修复小鼠缺血组织的目的。本研究为治疗下肢缺血性疾病提供了新思路。