论文部分内容阅读
研究背景：神经退行性疾病(neurodegenerative diseases)是威胁人类晚年生活质量的主要疾病之一,其发病机制十分复杂,暂无有效治疗方法。来源丰富、易获取的脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells, ADSCs)的自体移植在神经退行性疾病的治疗中具有极大的应用潜能。但随着哺乳动物年龄增长而出现的干细胞功能减退是自体干细胞移植所面临的一个难题。抑癌基因p16ink4a与人ADSCs的衰老密切相关、且在神经退行性疾病中存在过度表达,阻断p16ink4a基因可能有助于改善生理性衰老对干细胞功能的抑制。为提高自体移植ADSCs对神经退行性疾病的疗效,需对ADSCs是否存在增龄性衰老进行验证、对p16ink4a基因在老年个体中ADSCs中表达变化进行观察。本实验组推测：随着年龄增长ADSCs的细胞增殖及定向分化能力减退,细胞中p16ink4a基因表达增多,p16ink4a基因可能影响ADSCs的增殖与定向分化能力。目的：体外分离培养青年和老年SD大鼠脂肪组织中脂肪间充质干细胞(ADSCs),观察两组细胞形态、增殖能力、向神经细胞定向分化能力、衰老情况等方面的差异,并比较两组细胞中p16ink4a基因表达。方法：取SD大鼠的腹股沟和腹膜后脂肪,分离体外培养青年大鼠及老年大鼠ADSCs,观察形态并进行传代。取第3代细胞测定流式细胞术鉴定标志物CD11b、CD29、CD90, MTT比色法描绘生长曲线探查其增殖能力并比较两组差别。通过两步诱导法诱导ADSC向神经细胞方向分化,免疫荧光法检测分化后细胞Nestin、GFAP、Tubulin的表达情况,比较两组细胞分化能力的区别。对两组细胞进行衰老染色以观察干细胞衰老情况,Western blot、realtime PCR测定不同年龄的两组ADSCs中p16ink4a基因的表达差异。结果：1.从大鼠的脂肪组织中可成功提取ADSCs,并在含血清培养中能够连续传代并稳定增殖。青年组大鼠ADSCs增殖能力较老年组大鼠强(P<0.05)。提取的ADSCs强烈表达CD29、CD90,低表达CDllb。2.经诱导剂诱导后,ADSCs可分化成为神经元样细胞,表达Nestin、不表达GFAP及Tubulin,较之青年组大鼠ADSCs老年组细胞神经分化能力明显减弱(P<0.05)。3.老年组大鼠ADSCs中衰老细胞比例明显较青年组高(P<0.05)且p16ink4a基因表达明显增加(P<0.05)。结论：1.与青年大鼠ADSCs相比,老年大鼠ADSCs的增殖、定向分化能力均明显减弱。2.老年大鼠ADSCs中pl6ink4a基因的表达较青年组明显增高,提示pl6ink4a基因表达的上升可能影响老年大鼠ADSCs细胞的增殖、定向分化能力。