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田鼠巴贝斯虫是顶复门孢子虫纲梨形虫目的一种寄生于宿主红细胞内的血液原虫,主要经过硬蜱叮咬、输血或血液制品途径感染人或者啮齿类动物,极少数情况下是通过胎盘经母婴传播。具有免疫功能的个体通常无明显临床症状,但由于B细胞淋巴瘤、器官移植、HIV/AIDS或使用免疫抑制药物治疗而引起的免疫缺陷和免疫力低下的人群会增加患田鼠巴贝斯虫病的风险,严重时会导致多器官衰竭甚至死亡。目前在临床上主要采用阿托伐醌和阿奇霉素联合用药,但由于田鼠巴贝斯虫耐药性高,容易导致失败,且复发率高。糖酵解途径是顶复门原虫能量代谢的主要方式,在红细胞生命周期内田鼠巴贝斯虫高度消耗葡萄糖获取能量,且田鼠巴贝斯虫主要依靠无氧糖代谢产生ATP和乳酸,那么丙酮酸的获取至关重要,因此丙酮酸激酶（Py K）是田鼠巴贝斯虫能量获取的关键糖酵解酶,其有望成为一个药物靶标阻断丙酮酸的产生从而限制虫体的能量供应,抑制虫体增殖。本研究以田鼠巴贝斯虫Py K为基础,探索Py K催化活性及筛选其特异性抑制剂。具体如下:以田鼠巴贝斯虫c DNA和g DNA为模板,扩增到全长分别为1470 bp、1977bp的Py KⅠ、Py KⅡ目的片段,构建含GST标签的p GEX-6p-1-Py KⅠ与p GEX-6p-1-Py KⅡ原核表达载体,转化至大肠杆菌BL21后进行重组表达,从上清得到了纯化后的Py KⅠ与Py KⅡ蛋白。随后分别进行了鼠源和兔源多抗的制备,通过Western blot试验表明Py KⅠ与Py KⅡ免疫原性良好,虫体天然蛋白大小分别约为80 k Da和100 k Da。由于Py KⅡ重组蛋白难以提纯等原因,只对Py KⅠ重组蛋白进行GST标签的切除,探究其催化活性。通过变动PH值、Mg2+、K+以及底物浓度获得Py KⅠ的米氏常数KM、Kcat和Vmax等酶动力学参数,并确定了酶催化反应的最佳条件即3 m M PEP,1 m M ADP,PH=7.0的缓冲液。抑制剂筛选试验过程中,通过LDH酶偶联法筛选了13种药物,其中有6种药物对重组蛋白Py KⅠ酶活性产生抑制作用,分别为单宁酸、紫草素、芹菜素、PKM2 inhibitor、罗格列酮和吡格列酮。利用丙酮酸激酶活性检测试剂盒重复13种药物对Py KⅠ酶活性的影响,其结果基本与之前一致。体外培养实验筛选出单宁酸、紫草素、芹菜素、PYK-M2 inhibitor这四种药物均在微摩尔浓度内对田鼠巴贝斯虫生长有明显抑制效果,其中单宁酸细胞毒性相比较低。且在单宁酸体外抑制试验中,丙酮酸产物的回补能使药物组的染虫率得到部分恢复。综上所述,本研究分别对Py KⅠ和Py KⅡ基因进行了克隆,并探究了Py KⅠ的催化活性,通过酶活动力学试验和体外培养试验成功筛选出单宁酸、紫草素、芹菜素、PKM2 inhibitor这四种药物对Py KⅠ催化活性和田鼠巴贝斯虫体外生长的抑制效果。其研究结果将为设计和开发新的抗巴贝斯虫的药物提供理论基础,并对其他顶复门原虫糖代谢途径的研究具有一定的参考作用。